百日咳外膜囊泡的研究进展及其作为新型替代疫苗的可能性

刘兆禄，潘超 综述，朱力，王恒樑， 审校

1.上海海洋大学食品学院，上海201306；2.军事医学研究院生物工程研究所，北京100071

百日咳是由百日咳博德特菌引起的细菌性呼吸系统疾病，其他博德特菌菌种，如副百日咳博德特菌、支气管败血症杆菌和霍尔姆斯杆菌，也会引起相似的持续不断地咳嗽症状［1］。该病多发于儿童及婴幼儿，特别是6 个月以下的婴儿。目前，百日咳仍是儿童死亡的主要病因之一［2］。

为提高对新生儿的保护效果，美国免疫咨询委员会（Advisory Committee on Immunization Practices，ACIP）建议孕妇在孕27 ～ 36 周时接种无细胞百白破三联疫苗（tetanus，diphtheria toxoids and acellular pertussis vaccine，Tdap）［3］。母体免疫球蛋白在妊娠约30 周后可通过胎盘主动转移至胎儿，理论上，胎儿能够通过该机制获得足够高的抗体水平，出生后可得到保护［4］，但母体中高水平百日咳抗体经胎盘转移至胎儿可致婴儿在初次接种百日咳疫苗时免疫应答减弱，也称为“钝化”［5］。因此，需进一步评估孕妇免疫Tdap 疫苗后婴儿对全细胞百日咳疫苗的免疫应答。

目前使用的百日咳疫苗有两种，即全细胞疫苗（whole-cell pertussis vaccine，wP）和无细胞疫苗（acellular pertussis vaccine，aP）［6］。20 世纪中期，人类首次报道了可通过接种wP 来控制百日咳的发病率。wP 是由灭活的百日咳博德特菌组成，并与白喉和破伤风毒素疫苗联合为百白破三联疫苗（diphtheria，tetanus and whole-cell pertussis combined vaccine，DTwP），临床试验表明，DTwP 对百日咳发病率的控制非常有效［7］。接种DTwP 的人群虽降低了患百日咳的风险，但会伴有引发脑损伤或神经系统疾病等严重副作用。20 世纪70 年代中期，日本研发出由纯化百日咳毒素（pertussis toxin，PTX）、丝状血凝素（filamentous haemagglutinin，FHA）和百日咳黏着素（pertactin，PRN）及两种鞭毛蛋白（fimbriae types 2 and 3，Fim2 and Fim3）为抗原组成的新一代aP 疫苗。这种亚单位疫苗避免了wP 疫苗带来的安全隐患，还能诱导有效的保护性免疫应答，对预防和控制百日咳发病产生了重要影响。aP 疫苗在全球覆盖率越来越高，但许多国家的百日咳发病率在20 世纪90 年代却出现了明显反弹［8］。有研究表明，aP 疫苗在狒狒感染模型中不能预防百日咳博德特菌在呼吸道定植，不能改善其传播风险［9］。另外，近年欧美国家出现了ptxP3 系的菌株，其比ptxP1 株具有更高水平的PTX［10］，aP 疫苗对这些新菌株的保护效率可能降低。近20 年中，百日咳的流行病学特征发生了较大变化［11］，许多发展中国家发生了几次重大疫情，在疫苗接种率较高的发达国家也出现了类似情况［12］。因此，开发具有长效免疫能力和可对不同基因型菌株产生保护的新型百日咳疫苗尤为重要。

百日咳博德特菌的外膜囊泡（outer membrane vesicles，OMVs）是该菌表面分泌的一种具有球形双层膜、天然非复制性的囊泡结构［13］，在百日咳细菌生长、生存和毒力等生理活动中发挥重要作用，有研究证明，基于OMVs 的疫苗诱导的免疫应答比具有Th1 ／ Th17 和Th2 细胞谱的aP 疫苗更强大，可产生长期保护作用［14］，具有广泛的应用前景。因此，本文对OMVs 的研究现状及其作为新型替代疫苗的可能性作一综述。

1 OMVs 的生物学作用

百日咳博德特菌OMVs 直径一般在20～250 nm范围内，但某些情况下会变成不规则形状，直径最高范围也能增加至500 nm［15］。OMVs 可协助生物膜的形成，生物膜是由外多糖、DNA、蛋白质和许多其他分子基质组成的表面黏附结构。FULSUNDAR 等［16］证实，细菌在应激期间释放的OMVs 明显增加，表明OMVs 与生物膜的形成相关。OMVs 通过参与细胞的共聚集，为胞外多糖、DNA、蛋白质等物质及细菌细胞的相互作用提供了平台，为病原体创造一个适合宿主生存的微环境；其次，OMVs 能够在细胞间递送生物分子，保护胞内的运输分子免受外部环境稀释和降解。有研究表明，OMVs 在输送营养物质中具有重要作用，金属离子通常在自然细菌环境中是稀缺的，导致物种间和物种内对金属营养源的竞争［17］。百日咳博德特菌OMVs 可从环境中摄取铁并将其输送至细菌中，补充细菌生长所需的铁营养［18］。除上述作用外，OMVs 在杀死竞争微生物、对外界环境发生反应和保护细胞方面均具有重要意义。

2 百日咳博德特菌OMVs 的病理学功能

在博德特菌属中，参与毒力基因调控的主要双组分系统BvgAS 由传感器激酶BvgS 和响应调节剂BvgA 组成。BvgS 是一种“杂合”传感器激酶，在3 个不同的结构域中具有3 个磷酸化位点，介导BvgA 磷酸化。磷酸化的BvgA（即BvgA-P）以不同的结合模式与不同的毒力基因启动子结合以激活转录［19］。BvgAS 控制超过100 种毒力基因的表达，在两个不同的表型阶段，即毒性Bvg+阶段和无毒Bvg-阶段之间发挥转换作用［20］，且BvgS 和BvgA 序列在百日咳博德特菌菌株和临床分离株中几乎不变［21］。GASPERINI 等［18］采用蛋白质组学方法鉴定Bvg+和Bvg-毒力阶段百日咳OMVs 中差异表达的蛋白质，比较该病原体在其毒性或无毒状态下的外膜蛋白模式，结果发现，Bvg+OMVs 中特异性蛋白含量约占总蛋白的64%，在Bvg-OMVs 中降至约0.6%，该发现与百日咳杆菌BvgAS 双组分系统对毒力基因具有良好调控的结论一致。另一方面，Bvg-OMVs 中所有非Bvg+特异性蛋白质的数量普遍增加，在纳米粒子跟踪分析中进一步证明了Bvg-OMVs 外膜蛋白的补偿机制，即在Bvg+OMVs 和Bvg-OMVs 中囊泡蛋白质大小分布和数量无差异的情况下，Bvg-OMVs 中大多数蛋白质过度表达以弥补Bvg-外膜蛋白质的缺乏。在Bvg+OMVs 中，被Bvg 激活的FHA 和PRN的黏附素在OMVs 与上皮细胞的结合中不发挥作用。该结果也表明，百日咳菌及其OMVs 是通过不同的黏附分子分别与上皮细胞相互作用，且这种差异结合可在宿主与病原体相互作用过程中产生协同作用［22］。

前期研究表明，百日咳博德特菌OMVs 能够将表面的腺苷酸环化酶毒素ACT 传递给靶细胞使其中毒，而PTX 被鉴定为Bvg+特异性蛋白，且能够引起中国仓鼠卵巢CHO-K1 细胞的聚集，相比来自表达解毒PTX 的OMVs 未显示出毒性［23］。尽管Bvg+OMVs 表达的PTX 不足以诱导细胞死亡，但其能为细菌中毒宿主细胞提供重要的补充机制，与其他分泌毒素产生协同作用，有助于感染期间的炎症反应。

3 OMVs 作为预防性疫苗的可能性

3.1 O M V s的免疫原性 百日咳OMVs 含有免疫刺激剂和抗原分子，在机体中能激活宿主系统免疫应答。BOTTERO 等［24］将百日咳OMVs 与破伤风和白喉类毒素联合制备百白破三联疫苗TdapMOVsBp，制备的TdapMOVsBp 具有良好的安全性，并能有效诱导Th1 ／ Th2 混合免疫应答，这种混合的免疫反应赋予小鼠对百日咳的最佳保护能力，且相比于aP 疫苗能够提供更持久的获得性免疫保护。

ZURITA 等［25］评估了OMVs 能否通过肺部免疫对缺失PRN 的百日咳菌株提供保护，研究表明，OMVs 疫苗能够有效保护小鼠免受肺部百日咳PRN-菌株感染，且诱导的保护能力高于市售aP 疫苗。关于诱导免疫的持久性，研究发现，具有组织驻留记忆的CD4 TRM 细胞在OMVs 免疫接种后14 d积聚在小鼠的肺中。OMVs 疫苗诱导免疫小鼠呼吸TRM 细胞是一个重要的发现，已证明CD4 TRM 细胞在预防百日咳杆菌再感染的免疫中起着关键作用［26］。这种记忆CD4 T 细胞群可提供比天然T 细胞赋予的抗病原体反应更直接和有效的保护［27］。在用wP 疫苗免疫的小鼠中也能检测到CD4 TRM的存在，但在用商业aP 疫苗免疫的小鼠中并未检测到［26］。OMVs 实验主要针对肺部TRM 细胞，但不排除OMVs 在上呼吸道或肠道诱导TRM 细胞的可能性。用OMVs 和wP 疫苗免疫可诱导长期记忆T 细胞并扩散至全身，其中一部分细胞构成呼吸TRM 细胞群。在百日咳菌攻毒后，CD4 TRM 细胞诱导的干扰素γ（interferon γ，IFNγ）和白细胞介素-17（interleukin-17，IL-17）水平显著升高，并可提供长期有效的保护。

3.2 O M V s作为黏膜佐剂和抗原载体 由于无细胞疫苗引发的不是保护免受感染最有效的免疫反应，且亚单位疫苗本身能够诱导的免疫效率不高，迫切需要能够引发体液、细胞和黏膜免疫的新型免疫增强剂和递送载体来有效地提高抗原的提呈效率。OMVs 具有独特的免疫学和结构特征，包括纳米尺度的囊泡结构、自佐剂效应、对外源性大分子量蛋白的耐受性和携带免疫刺激物的能力，使其能够作为一种有效的黏膜佐剂和抗原载体。虽然许多纳米材料，如聚合物纳米颗粒、无机纳米颗粒、脂质体和乳液等，也能够作为递送载体将抗原转移至抗原呈递细胞，但其不具有天然刺激免疫系统能力［28］。OMVs将抗原呈递与自身佐剂特性相结合，使其非常适合作为疫苗载体。

3.3 降低O M V s内毒性 安全性是实现百日咳OMVs 应用的重要问题之一。天然百日咳OMVs 由于含有完全内毒素的脂寡糖（lipooligosaccharide，LOS），能够诱导过度的免疫激活和炎症，不能直接用于疫苗生产。因此，降低LOS 活性对于百日咳OMVs 的应用至关重要。传统的OMVs 通过脱氧胆酸盐（deoxycholate，DOC）等洗涤剂能够降低LOS 含量，但也有诸多缺点：DOC 在去除LOS 的同时会去除OMVs 外膜局部脂蛋白，其中一些是疫苗的重要组成成分，如H 因子结合蛋白（factor H-binding protein，fHbp）；DOC 处理的OMVs 易聚集，使OMVs 在生产操作过程中更加复杂化［29］。

ASENSIO 等［30］研究了脂肪酶PagL 的表达对百日咳OMVs 内毒素活性和保护能力的影响，结果表明，PagL 会引起类脂A 的脱酰化，调节TLR4 ／ MD-2受体复合物对类脂A 的识别并降低内毒素活性。通过小鼠模型证明，与对照组OMVsBp 相比，OMVs-BpPagL 组展示了其低毒性的优势，且诱导IL-1 和IL-6 的水平低于OMVsBp，这些结果与小鼠体重增加试验中观察到的低毒性和OMVBpPagL 诱导的促炎性能力降低一致［30］。作为免疫佐剂和内毒素拮抗剂的类脂A，如何对其修饰从而降低LOS 的内毒性是应用百日咳OMVs 的重要方面。了解类脂A 的生物化学及其对发病机制的影响，可在百日咳感染期间提供有效的治疗方案。

3.4 喷雾干燥百日咳O M V s的应用 越来越多的研究证明基于百日咳OMVs 疫苗是一个较有潜力的候选疫苗。KANOJIA 等［31］开发了一种喷雾干燥的OMVPV，这种方式不影响OMVPV 的结构完整性，与液体OMVPV 配方相比具有更高的稳定性。在通过小鼠的肺部途径给药时，喷雾干燥的OMVPV 显示出与液体OMVPV 相当的免疫应答和针对百日咳博德特菌的特异性保护。除广泛的系统性IgG 和Th1 ／ Th17 应答外，喷雾干燥的OMVPV 还能够诱导黏膜IgA 和Th17 细胞免疫应答。喷雾干燥技术可提高OMVPV 冷链外的长期储存，避免了由冷冻干燥引起的对抗原的潜在损害。另外，喷雾干燥的优势也在于其干燥颗粒可用于肺部、鼻内或口服给药过程［28-33］，对于百日咳稳定疫苗在全球的输送和应用具有实质性优势。

4 展 望

全球范围内百日咳发病率呈增长趋势，开发新一代疫苗需要进一步研究百日咳博德特菌的发病机制和免疫力。百日咳OMVs 具有作为有效疫苗产品所需的许多功能，包括引起体液反应的膜表面抗原的天然结构、诱发T 细胞介导免疫反应的潜能、多个PAMPs 的存在触发先天免疫反应及适合抗原呈递细胞有效加工的体积。这些优势使其作为第三代百日咳疫苗具有巨大的市场潜力。但对于OMVs 的开发仍存在一些障碍，如尚无大规模临床和临床前评估、对OMVs 制造工艺的了解有限及研究成本的投资不足。随着人类对几种基于脑膜炎球菌OMVs 疫苗的上市批准［32］，百日咳OMVs 作为新型疫苗产品也将具有广泛的应用前景。