柯萨奇病毒A 16 型疫苗的研究进展

冯骁 综述，李琦涵 审校

中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室，云南 昆明650118

手足口病（hand，foot and mouth disease，HFMD）是由肠道病毒引起的传染病，肠道病毒包括20 多种类型，其中柯萨奇病毒A16 型（Coxsackievirus type A 16，CA16）和肠道病毒71 型（enterovirus71，EV71）最常见。HFMD 可引起5 岁以下儿童的口腔疼痛、厌食、低热及手、脚和口腔溃疡，大多数儿童约1 周痊愈，但也可能导致少数儿童出现心肌炎、肺水肿、无菌脑膜炎等并发症［1］，其中重症病例可能出现病情的迅速发展，甚至导致死亡。HFMD 多次在全球范围内流行暴发，大多数由CA16 和EV71 引发，目前EV71灭活疫苗已上市［2-3］，但CA16 疫苗研究进展仍较缓慢。因此，CA16 感染机制的研究及CA16 疫苗的研发仍是目前解决该病公共卫生问题的热点和关键。CA16 疫苗的研发可充分借鉴EV71 疫苗的工艺、质量控制及评价标准。目前，许多企业及机构开展了CA16 全病毒灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗、DNA 疫苗、病毒样颗粒样（virus-like particle，VLP）疫苗的研发。本文就上述类型CA16 疫苗的研发进展作一综述。

1 CA16 的病毒形态及基因结构特征

CA16 属于小核糖核酸病毒科肠道病毒属，病毒颗粒呈20 面体立体对称的球形结构，直径23～30 nm，由内部核酸和衣壳蛋白质组成，无脂质包膜。其核酸为单股正链RNA，全长约7 410 个核苷酸。RNA两端为5′和3′非编码区，中间的开放阅读框编码1个多聚前体蛋白，经蛋白酶水解为P1、P2 和P3 3 个前体蛋白，P1 可进一步酶解为VP1、VP2、VP3、VP4，共同组成病毒衣壳，VP1 含病毒主要的中和抗原决定簇［1］。

2 CA16 流行病学调查

2.1 C A 16 流行范围 有研究显示，CA16 的感染率高于EV71，CA16 引起的HFMD 流行在全球范围内均有报道。1994 年，英国暴发了严重的HFMD，此次导致流行的病原是CA16［4］；芬兰暴发的HFMD的主要病原也是CA16［5］；日本监测数据提示，CA16每3 年流行1 次［6］；在中国许多省份均有CA16 作为主要流行株引发HFMD 的报道，如上海、武汉等［7-9］。另外，由CA16 引发的重症和死亡病例也在美洲和南亚［10］的许多地区有报道。

2.2 C A 16 的致病性 CA16 会引起5 岁以下婴幼儿出现发热、手足口疱疹和溃烂等，极少数重症患儿也可出现肺炎、心肌炎、脑膜炎等致死病症［11］。根据CA16 分子流行病学的调查研究显示，CA16 基因组具有低保真复制和频繁重组的特点，导致了CA16 具有高突变率的特性［12］。同时HFMD 流行病学提示，EV71 与CA16 常交替或共同流行［13］。这些证据均表明CA16 与EV71 将有较大几率发生基因重组，且导致更为严重和复杂的HFMD。已上市的EV71 疫苗对CA16 无交叉保护作用，不能对由其他病原体引起的HFMD 起到预防保护作用［14］，因此研制有效的CA16 疫苗对HFMD 的防治将起到至关重要的作用，可扩大HFMD 的防治范围。

3 CA16 疫苗研发的可行性

3.1 中和抗体对人群的保护效果 在对于CA16 流行病学调查研究发现，人感染CA16 后产生的中和抗体可保护人群避免二次感染［15］，提示CA16 的中和抗体可对其感染产生保护作用，这为CA16 疫苗的研发提供了可能和基础。另外，有调查表明，新生婴儿体内的CA16 的抗体水平较高，但约9 月龄时开始减少，5 岁以上的幼童抗体水平又接近成人［16］，该结果符合HFMD 多发于9 月龄～5 岁婴幼儿的特征，这也提示了人体内相关中和抗体水平与HFMD 的发病率呈负相关，中和抗体可保护人体对抗HFMD。在以上流行病学调查基础上，为验证中和抗体的保护作用，多项研究进行了细胞水平和动物水平试验，结果也证实了中和抗体具有保护作用［17-19］。这些均为CA16 疫苗的研发提供了基础和可能。

3.2 EV 71 及其他肠道病毒疫苗的研发经验 目前已有肠道病毒疫苗（脊髓灰质炎减毒活疫苗，全病毒灭活EV71 疫苗等）成功上市，其中EV71 与CA16 的遗传物质有较高的同源性，同类肠道病毒的毒株筛选、制备工艺、质控标准、动物模型的建立将为CA16疫苗的制备提供依据［20］。

4 CA16 疫苗相关的研发进展

4.1 免疫原性评价 免疫原性是抗原的一种特性，用疫苗模拟病原体接种机体后，抗原能刺激特定的免疫细胞，使免疫细胞活化、增殖、分化，最终产生免疫效应物质抗体和致敏淋巴细胞，抗体和致敏淋巴细胞则直接抵御病原体的入侵。因此，免疫原性是评价疫苗有效性的重要指标。体液免疫和细胞免疫是构成适应性免疫反应的两个方面，CD4+T 淋巴细胞具有激活B 淋巴细胞和CD8+T 淋巴细胞的功能。B 淋巴细胞主要产生中和抗体，中和抗体通过阻止病原体入侵宿主细胞而发挥体液免疫的作用；CD8+T 细胞通过靶向杀伤病原体入侵的宿主细胞而发挥细胞免疫的作用。当病原体再次入侵机体时，记忆B 细胞和记忆T 细胞迅速反应，保护机体不受感染和损伤［21］。且在中和抗体不足的情况下，机体主要靠细胞免疫发挥作用。因此，体液免疫和细胞免疫是免疫原性评价的指标，免疫原性的评价是通过对体液免疫和细胞免疫的评价来实现的。目前，评价免疫引起的病原体特异性细胞免疫反应多通过体外检测脾细胞分泌细胞因子水平和淋巴细胞增殖反应［15］，评价免疫引起的病原体特异性体液免疫反应则是通过体外检测血清中中和抗体的效价。

4.2 动物模型 由于EV71 和CA16 在基因组成和氨基酸序列上的高度同源性，可借鉴EV71 疫苗研制的流程和评价方法来研发CA16 疫苗。目前，EV71疫苗逐步在乳鼠模型、恒河猴模型中成功验证了疫苗的有效保护性［22-23］，这些均推动了疫苗由实验室试验过度至临床试验，最后将成功上市。本课题组在前期研究中制备了相关实验性CA16 疫苗，同时参考EV71 疫苗动物模型建立了CA16 疫苗有效性评价的小鼠模型，在此模型中验证了CA16 疫苗的免疫原性和保护性；随后，在小鼠模型成功的基础上建立了恒河猴模型，模拟了人类感染CA16 病毒引起的典型的疱疹、病毒血症和临床状态，并对恒河猴进行免疫后攻毒，结果显示，制备的疫苗刺激猴机体可产生特异性免疫反应，但对猴机体未产生有效的保护作用，表明制备的CA16 疫苗可能不具有有效性［15］，此项研究为改进CA16 实验性疫苗提供了依据。小鼠模型、猴体模型在CA16 疫苗研发中发挥了重要作用。

4.3 疫苗研发类型

4.3.1 全病毒灭活疫苗 传统疫苗多为灭活疫苗，此类疫苗具有良好的保护效果，且安全性较高，因此在CA16 疫苗的研发过程中，许多研究均采用了抗原的灭活法制备疫苗。CAI 等［24］选用CA16 临床分离株通过β 丙内酯灭活后免疫小鼠，结果表明，其具有较好的免疫保护效果：分离得到的抗血清能在CA16-MAV 的致死性攻击中保护新生小鼠；选用病毒株CA16-SZ05 和CA16-G08 制备灭活疫苗，分别免疫幼鼠和成年小鼠，可产生较好的交叉保护效果。该疫苗在幼鼠及成年小鼠体内，对同源及非同源病毒均能有较好的防御作用。CHEN 等［25］用甲醛灭活CA16 临床分离株免疫小鼠，也观察到较好的免疫原性及保护作用。但YANG 等［26］用CA16 灭活疫苗对乳鼠和猕猴进行免疫试验，诱导的中和抗体效价不高，在体内存留时间较短。

4.3.2 减毒活疫苗 JIANG［27］对FY18、KMM ／ 08、KM208 株和临床样本分离获得的7 株CA16 在KMB17 细胞中通过连续低温传代的方式进行减毒，经以感染性滴度、抗原含量、致病性、免疫原性等为指标的筛选后，获得KM168-8、KM154-6 两株11 代次的减毒株，感染性滴度≥6.50 1gCCID50／ mL 时，对乳鼠不致病，无病理损伤，且单一稳定；对乳鼠加强免疫后，抗体效价较高，抗体阳转率达100%。因此，这些减毒株适宜进行后续的减毒疫苗开发。

4.3.3 亚单位疫苗 结构蛋白VP1 是CA16 中和抗原决定簇的主要集中部位，许多实验室通过表达VP1 制备亚单位疫苗，这些研究的区别主要是其表达系统不同。YANG 等［28］采用CA16 青岛株的VP1序列并利用原核表达技术在大肠埃希菌中表达了CA16 VP1 重组蛋白，经纯化后免疫小鼠，结果显示，血清中和抗体效价均低于1 ∶8，不具有制备CA16 疫苗的潜力。LI 等［29］利用CA16 山东株的序列在Bacto-Bac 杆状病毒Sf9 昆虫细胞表达系统制备了VP1蛋白疫苗，免疫小鼠后，结果显示该疫苗可诱导特异性细胞免疫和体液免疫。

4.3.4 DNA 疫苗 DNA 疫苗是指将编码某种蛋白质抗原的重组真核表达质粒直接注射至动物体内，使外源基因在活体内表达，研究可根据预期抗原表位设计重组表达质粒，因此该类疫苗具备好的免疫原性和减毒的优点，同时又无逆转的风险，具有较大的应用潜力，视为继传统疫苗及基因工程亚单位疫苗后的第三代疫苗。TUNG 等［30］制备了EV71 DNA 疫苗，免疫小鼠后可产生血清特异性IgG 和中和抗体，同时，产生了细胞免疫应答，实验也为CA16 DNA 疫苗的研发起到推动作用。LIU 等［31］在减毒伤寒沙门菌中成功构建了稳定的重组质粒VR-CVP1，其能在Vero细胞中成功表达出CVA16 VP1 蛋白，且在转染的Vero 细胞中具有抗原活性。实验提示，该蛋白可能会在动物体内表达且具有免疫原性，为CA16 DNA 疫苗的研发提供了可能。与传统的减毒或灭活疫苗相比，DNA 疫苗的研制周期更短，同时也降低了成本，且具备良好的免疫原性和减毒的优点，无逆转风险，因此DNA 疫苗将是未来疫苗发展的方向。

4.3.5 V LP 疫苗 VLP 疫苗也是研究的热点之一。目前报道的CA16 VLP 疫苗由于同时表达结构蛋白P1 和酶蛋白3CD，均可通过3CD 切割P1 实现VLP自组装，VLP 疫苗由于其表达系统不同而有许多种类。ZHAO 等［32］利用酵母表达系统表达的VLP 可刺激机体产生特异性中和抗体，具有良好的免疫原性。VLP 疫苗诱导的中和抗体滴度较其他疫苗高，对CA16 疫苗的开发有较大潜力。CHEN 等［33］对昆虫细胞-杆状病毒系统进行密码子优化，针对P1 基因和3CD 基因，在杆状病毒基因中插入启动子P10 进行优化。利用Bac-to-Bac 杆状病毒系统表达CVA16 VLP，随后免疫小鼠，可诱导高滴度中和抗体。另外，LYU 等［34］对酿酒酵母表达的EV71 VLP 进行晶体结构分析研究，通过在保留EV71 VLP 线性和构象中和表位的同时置换了VP1 GH 环上的4 个氨基酸，保证其特异性和增加其同源性，设计出EV71 ／ CA16嵌合VLP 新VLP 疫苗的制备思路。实验结果证明，该嵌合VLP 可保护机体抵御两种病毒的感染，为HFMD 疫苗的研发提供了新的方向和手段。

5 展 望

EV71 疫苗上市以来，已有效地降低了HFMD 重症和死亡的发生率，但其缺乏交叉保护性，不能抵抗其他病原体引起的HMFD［35］。因此，研发CA16 疫苗将成为防治HFMD 的重点。CA16 中和抗体的保护作用为CA16 疫苗的研发提供了依据，该疫苗的研发可充分借鉴EV71 疫苗的工艺、质量控制及评价标准。目前，多家企业及机构开展了CA16 全病毒灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗、DNA 疫苗、VLP疫苗的研发。但CA16 病毒特性、流行特征、分子流行病学、血清流行病学、发病机制及保护机制等相关基础研究，已成为CA16 疫苗研发中亟待解决的问题，需多部协作攻关，为疫苗研发提供理论基础。另外，免疫原性和保护效果是疫苗有效性评价的关键指标，需开展相关评价方法和标准品研制及体内外保护效果的平行性研究，建立标准化的评价平台，确保疫苗有效性评价的特异性、可靠性和稳定性。