苹果青枣酵素发酵过程中生物学特性和抗氧化活性研究

宋爱伟，毕 红，陈亚军，吴林生，徐德聪，王 伟

(合肥师范学院 生命科学学院，安徽 合肥 230601)

1 研究背景

苹果作为人们最经常食用的水果之一，从其个头的大小、鲜艳程度、表面光滑度和气味香度等方面区分，可分为三大类：一类是尾食品种；一类是酒用品种；一类是烹调品种[1]。不同品种的苹果，丹宁、酸度与糖分的含量各不相同[2]。此外，苹果还具有降低胆固醇、保护肺部不受烟尘的影响、缓解不良情绪和提神醒脑等功能。苹果中含有人体所需的大多数微量元素，饭前吃苹果可以使人食欲降低，从而减少进食量，达到减肥的目的。这些特性，使得苹果深受大众的喜爱。

青枣学名牛奶枣，是一种常见的热带水果。其中含有丰富的营养物质，有清凉解毒的功效。[3]此外，其还具有抗氧化、抗癌等功能，可以增强人类的免疫力、促进血液循环，常常吃青枣，不但可以美容养颜，而且还能够延缓衰老。

苹果和青枣通常作为鲜食或用来打浆收汁，但收汁剩下的苹果泥和青枣泥往往当垃圾丢弃，这样不但浪费资源而且污染环境。苹果泥和青枣泥糖类含量非常高，两者所含的大量营养成分为微生物的生长提供了良好的环境。因此，将苹果泥和青枣泥经微生物发酵制成酵素，可以减少资源浪费，为农产品深加工和带动产业扶贫提供新的思路。

由于苹果和青枣都是常见的可食用水果，研究主要探究用这些可食用水果做成可食用植物酵素[4]。可食用植物酵素的营养物质含量非常多，含有微生物发酵中产生的一些次级代谢产物及其活性成分，而其本身就含有多种酶、维生素和矿物质元素等[5]。相比于直接食用青枣和苹果，可食用酵素中的营养物质更加容易被人体吸收利用。

以新鲜苹果泥和青枣泥作为原材料，研究在发酵过程中各种生物学特征的改变以及酵素液中的抗氧化活性变动规律。以期为可食用苹果青枣酵素作用和功能的进一步阐释、分析提供理论基础。苹果青枣酵素所呈现出的良好生理活性与其发酵过程有着紧密的联系，但目前苹果青枣混合发酵的酵素类型却鲜有报道。因此，深入地探究苹果青枣酵素在发酵环境中的各种生物学特征和其抗氧化活性的改变，对研究和开发高品质的苹果青枣酵素产品具有重要作用。

2 实验材料与方法

2.1 实验材料

实验所使用的实验材料见表1。

表1 生物学特性和抗氧化活性研究实验材料

2.2 实验仪器

实验所用仪器见表2。

表2 生物学特性和抗氧化活性研究实验仪器

2.3 实验方法

2.3.1 苹果青枣酵素的制备

将苹果泥和青枣泥与水1:2混匀后，加入不同含量的木聚糖酶(0U/g，150U/g，300U/g，450U/g，600U/g)，首先55℃酶解5h，再加入2%蔗糖、0.05%磷酸氢二钾、0.2%酵母膏、0.1%氯化锌、0.1%硫酸镁、0.05%磷酸二氢钾。灭菌、冷却后，接种0.25%酵母菌，于30℃发酵24h，接种0.1%乳酸菌，37℃下发酵24h，最后于2～8℃下发酵24h，使基质产香[6]。

2.3.2 生物量的测定

取适量发酵液，离心沉淀后即为生物[7]。

2.3.3 pH值的测定

按照pH计说明书指导测定[8]。

2.3.4 可滴定酸度的测定

吸得1mL发酵液测量其重量，记为(W)，后定容至100mL的蒸馏水中，则稀释倍数为100，记为(F)，加入酚酞指示剂4滴，用0.1%mol/L NaOH(C)溶液滴定至微红色30s内不褪色，记录消耗NaOH的体积(V)，平行测定三次。可滴定总酸度的计算公式：

总酸度(%)=V·C·K·F×1000/W

K为酸的换算系数[9]。

2.3.5 还原糖含量的测定

参照DNS法[10]。

2.3.6 总黄酮含量的测定

称取20mg芦丁标准品于200mL的容量瓶中，加入70%乙醇溶液溶解并定容，得到0.1mg/mL的芦丁标准溶液。分别吸取0.00mL，0.30mL，0.60mL，1.20mL，1.80mL，2.40mL，3.00mL标准液于5mL的容量瓶中，加入0.4mL 5%亚硝酸钠溶液，静置6min后加入0.4mL 10%的硝酸铝溶液，静置6min，然后加入1.2mL 4%的氢氧化钠溶液，用70%的乙醇溶液定容，摇匀，静置15min后于510nm处测定吸光度，同时设置空白对照。发酵液经离心后收集上清液，按照上述方法测得510nm处吸光度，通过标准曲线计算发酵液中黄酮含量(mg/mL)[11]。

2.3.7 还原力的测定

参照铁氰化钾法[12]，吸光度的高低与还原力强弱成正比。

2.3.8 羟自由基清除力的测定

参照邻二氮菲法[13]。

2.3.9 超氧化物歧化酶(SOD)活力的测定

参照邻苯三酚自氧化法[14]。

3 实验结果与分析

3.1 发酵过程中生物量的变化

由图1可知，在苹果和青枣酵素发酵过程中，生物量呈现不断上升的趋势。其中，30～42h生物量快速上升，可能是由于乳酸菌快速增殖，产生了大量的代谢产物，导致生物量快速上升；但当到达42h后，生物量几乎不再增加，可能是由于发酵时间过长，湿菌体繁殖受到抑制。同时，在发酵前期加入的木聚糖酶的含量对于溶液的生物量也有影响，同等发酵时间下，木聚糖酶的含量越高生物量越多，当木聚糖酶的含量为600U/g时，生物量最高。

图1 发酵过程中生物量的变化

3.2 发酵过程中pH值的变化

由图2可知，由于酵母菌是需氧型真菌，在发酵前期，采用通气发酵会使发酵液的pH值降低，这可能是由于酵母菌代谢生成的有机物质造成的；24h之后接入乳酸菌，因为乳酸菌是厌氧型细菌，所以对发酵液进行静置封闭发酵。结果显示：发酵液的pH值降低的速度会加快，大量增加的乳酸菌会不断将糖类等物质转化成乳酸，从而导致发酵液酸度上升。同时，在发酵前期加入木聚糖酶的含量对于发酵液的pH值也有一定的影响，木聚糖酶的含量越低，溶液的酸度越弱，pH值越大，其中不加入木聚糖酶时的发酵液的pH值最大，48h后pH值为4.31。

图2 发酵过程中pH值的变化

3.3 发酵过程中可滴定酸度的变化

由图3可知，随着发酵的不断进行，可滴定酸度总体呈现出不断上升的趋势，在0～24h时，酵母菌产生二氧化碳、有机酸等物质，导致发酵液的酸度不断上升；24h后又加入的乳酸菌将碳水化合物转化为乳酸，也导致了发酵液的酸度不断上升。在发酵前期加入木聚糖酶的含量对于发酵液的酸度也有影响，木聚糖酶的含量越高，溶液的酸度越强，则可滴定酸度越高，其中可滴定酸度最高的为加入600U/g木聚糖酶的发酵液，达0.65%。

图3 发酵过程中可滴定酸度的变化

3.4 发酵过程中还原糖含量的变化

如图4所示，实验得到的葡萄糖标准溶液标准曲线方程为y=0.5788x-0.0148，R2=0.9985。由图5可知，还原糖含量在6h内呈现上升趋势，可能是因为在发酵过程中酵母菌充分发动蔗糖酶水解蔗糖诱使蔗糖不断水解为葡萄糖和果糖，使得还原糖含量呈现上升的趋势，在发酵6～24h期间还原糖含量呈现不断下降的现象能说明这个阶段酵母菌增殖量较大。加入乳酸菌之后，在6h内还原糖含量下降速度较明显，表明这个阶段乳酸菌繁殖量也比较大。同时，在发酵前期加入木聚糖酶的含量对于溶液的还原糖含量也有影响，木聚糖酶的含量越高，还原糖的含量越高，发酵后期，木聚糖酶的加入量对于还原糖含量影响不大，还原糖的最低含量趋近于0.174mg/mL。

图4 葡萄糖标准曲线图

图5 发酵过程中还原糖含量的变化

3.5 发酵过程中黄酮含量的变化

如图6所示，实验所得的黄酮标准溶液标准曲线方程为y=0.0019x-0.019,R2=0.9948。由图7可知，发酵过程中黄酮含量总体呈不断上升的趋势，尤其是在接种乳酸菌后，黄酮含量上升明显变快，表明这个阶段乳酸菌繁殖量也比较大。在发酵过程中乳酸菌可能会破坏植物的细胞壁，而黄酮类物质大部分会与细胞壁中的木质素结合在一起，当细胞壁遭到破坏时，发酵液中的黄酮含量则会上升。同时，在发酵中加入木聚糖酶的含量对于溶液的黄酮含量也有一定的影响，木聚糖酶含量越高，黄酮含量越高，最后都趋近于359mg/mL，但未加木聚糖酶的含量明显偏低，趋近于315mg/mL，可能是木聚糖酶在发酵过程中，破坏了苹果和青枣的细胞壁，使得黄酮的含量有所增加。

图6 黄酮标准曲线图

图7 发酵液过程中黄酮含量的变化

3.6 发酵过程中还原力的变化

由图8可知，随着发酵时间的延长，发酵液中还原力总体呈上升趋势，可能是由于酵母菌和乳酸菌本来就有一定的抗氧化性，也可能是菌体表面和代谢产物中存在一定量的抗氧化物质。酵母菌和乳酸菌的发酵会很大程度的提高苹果青枣酵素的抗氧化活力。同时，在发酵前期加入木聚糖酶的含量对于溶液的还原力也有一定的影响，随着木聚糖酶含量的增高，发酵液的抗氧化性会增强，故还原力会不断升高。其中不加木聚糖酶的发酵液还原力最低，在48hOD值达到0.208，加入600U/g木聚糖酶的还原力最高，在48hOD值达0.268。

图8 发酵液过程中还原力的变化

3.7 发酵过程中羟自由基清除率的变化

由图9可知，随着发酵时间的推移，发酵液内羟自由基的清除率逐渐呈现不断增加的趋势，这很有可能是因为酵母菌和乳酸菌自身都具有较强的抗氧化作用。此外，发酵过程中酵母菌和乳酸菌可能诱发发酵液对超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、还原型辅酶Ⅰ氧化酶和还原型辅酶Ⅰ过氧化酶等多种抗氧化酶产生清除活性氧的活动[15-17]。说明苹果青枣酵素经过酵母菌和乳酸菌的发酵，其抗氧化性得到了极大的增强。同时，在发酵前期添加木聚糖酶的含量对于发酵液中的羟自由基清除率也会产生影响，木聚糖酶的含量越高，羟自由基清除率越高，但在发酵达48h后都趋近于99%。

图9 发酵液中羟自由基清除率的变化

3.8 发酵过程中SOD酶活力的变化

由图10可知，发酵液中SOD酶活力会随着发酵的时间增加而增强。对照图1中生物量的结果来看，可以很明显地看出两个图具有相关性。这些现象表明了乳酸菌和酵母菌两种菌类都可以产生超氧化物歧化酶使苹果青枣酵素的抗氧化活性得到提高。同时，在发酵前期加入木聚糖酶的含量对于发酵液的SOD酶活力也有一定的影响，木聚糖酶的含量越高，SOD酶活力也越强，当加入的木聚糖酶含量为600U/g时，SOD酶活力达到111U/mL。

图10 发酵液中SOD酶活力的变化

4 实验结论

本文以新鲜的苹果泥和青枣泥作为原材料，在基质中加入了两种常用菌种发酵(乳酸菌和酵母菌)，研究了在发酵过程中的各种生物学特性和抗氧化活性的变动规律。在发酵过程中，通过测量可以得出：(1)生物量不断上升，当到达42h后，生物量几乎不再增加，当木聚糖酶的含量为600U/g时，生物量最高为1.09g。(2)pH值呈现下降趋势，不加入木聚糖酶时的发酵液的pH值最大，48h后pH值达4.31。(3)可滴定酸度总体呈现出不断上升的趋势，可滴定酸度最高的为加入600U/g木聚糖酶的发酵液，达0.65%。(4)还原糖含量在6h内呈现上升趋势，在发酵6～24h期间还原糖含量不断下降，说明这个阶段酵母菌增殖量较大；加入乳酸菌之后，在6h内还原糖含量下降速度较明显，表明这个阶段乳酸菌繁殖量也比较大；木聚糖酶的含量越高，还原糖的含量越高，发酵后期，木聚糖酶的加入量对于还原糖含量影响不大，还原糖的含量趋近于0.174mg/mL。(5)黄酮含量呈不断上升的趋势，木聚糖酶含量越高，黄酮的含量越高，最后都趋近于359mg/mL，但未加木聚糖酶的含量明显偏低，趋近于315mg/mL。(6)还原力总体呈上升趋势，在48hOD值达到0.208，加入600U/g木聚糖酶的发酵液还原力最高，在48hOD值达0.268。(7)羟自由基的清除率逐渐呈现不断增加的趋势，木聚糖酶的含量越高，羟自由基清除率越高，在发酵48h后清除率趋近于99%。(8)SOD酶活力不断上升，木聚糖酶的含量越高，SOD酶活力也越强，当加入的木聚糖酶含量为600U/g时，SOD酶活力达到111U/mL。

综上，经酵母菌和乳酸菌发酵后的苹果青枣酵素的抗氧化活性大大提高，利用收汁后的苹果泥和青枣泥，不但避免了浪费，还减少了环境污染，实现了资源的充分利用，为农产品深加工和带动产业扶贫提供新思路。