固相萃取净化-超高效液相色谱-三重四极杆质谱法测定土壤中草铵膦、草甘膦及其代谢物氨甲基膦酸

2021-04-18孙文闪诸骏杰钟寒辉董叶箐

理化检验-化学分册 2021年4期

孙文闪,诸骏杰,钟寒辉,董叶箐,俞婕,刘静

(绿城农科检测技术有限公司,杭州 310051)

草甘膦是一种无选择性的除草剂,因具有低毒、廉价、高效等特点而应用广泛。草甘膦虽然在土壤中能够很快地与铝、铁等金属的离子结合而失去化学活性,但是其会在环境和生物体内不断富集。草甘膦和其代谢物氨甲基膦酸在通过食物和水进入人体内后,会对人体健康造成一定危害[1]。草铵膦具有低毒、杂草吸收好、活性高、杀草广谱、环境兼容性强等特点,是世界第二大转基因作物耐受除草剂,其速效性介于百草枯和草甘膦之间[2-4]。随着草甘膦和草铵膦使用量的不断上升,其对人体健康产生的风险也越来越受到广泛关注。因此,建立一种简单、准确、灵敏、快速地同时测定土壤中草甘膦及其代谢物氨甲基膦酸和草铵膦残留的方法,可为土壤中草甘膦及其代谢物氨甲基膦酸、草铵膦残留监测提供技术保障。

目前,草铵膦、草甘膦及其代谢物氨甲基膦酸的测定方法以液相色谱-质谱联用法[5-16]为主流。由于草铵膦、草甘膦、氨甲基膦酸均为强极性化合物,具有不溶于大部分有机溶剂、难挥发、缺少荧光和发色基团、在常规反相柱上没有保留等特点,它们不能直接通过液相色谱进行分离,也无法直接通过紫外、荧光、质谱等检测器进行测定。有文献通过衍生反应来改变这些物质在液相上的色谱行为并提高其在检测器上的响应值,但是,这种方法的前处理操作程序繁琐,衍生反应时间较长。其他的非衍生直接测定的方法报道的较少,文献[17]采用亲水色谱柱分离的液相色谱-质谱联用法直接测定稻米中的草甘膦及其代谢物氨甲基膦酸的含量;文献[18]采用反反相色谱-串联质谱法直接测定了植物源性食品中草甘膦及其主要代谢物氨甲基膦酸的含量;文献

[19]建立了高效液相色谱-三重四极杆质谱直接测定荔枝和香蕉中草铵膦及代谢物的方法。但是,还没有关于非衍生液相色谱-质谱联用法直接同时测定土壤中草甘膦、氨甲基膦酸、草铵膦含量的报道。因此,本工作建立了一种固相萃取净化-超高效液相色谱-三重四极杆质谱同时测定土壤中的草铵膦、草甘膦及其代谢物氨甲基膦酸残留的方法,以期为土壤中草铵膦、草甘膦及其代谢物氨甲基膦酸残留的同时快速测定提供技术参考。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

LC 30A 型超高效液相色谱;8050型三重四极杆质谱仪;Oasis HLB固相萃取小柱;ST 16R 型高速离心机;T18型高速组织匀浆机;Milli-Q 型超纯水仪;BSA 224S型电子天平。

草铵膦、草甘膦、氨甲基膦酸的单标准储备溶液:200 mg·L-1,介质为水,于4 ℃保存。

基质匹配混合标准溶液系列:取适量草铵膦、草甘膦、氨甲基膦酸的单标准储备溶液,用空白样品溶液将其逐级稀释成草铵膦的质量浓度为0.005,0.01,0.05,0.1,0.2,0.5 mg·L-1,草甘膦、氨甲基膦酸的质量浓度为0.01,0.02,0.1,0.2,0.4,1.0 mg·L-1的基质匹配混合标准溶液系列。

二氯甲烷、乙腈、氨水为色谱纯,乙酸铵为色谱纯;草甘膦、氨甲基膦酸和草铵膦标准品的纯度不小于98%;试验用水为超纯水。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱条件

Dikma Polyamino 氨基色谱柱(150 mm×2.0 mm,5μm),柱温30 ℃;进样量20μL;流量0.2 mL·min-1;流动相:A 为乙腈,B 为5 mmol·L-1乙酸铵溶液(用氨水调节pH 至12)。梯度洗脱程序:0～4.5 min 时,A 由80%降至20%,保持2.0 min;6.5～13.0 min时,A 由20%升至80%。

1.2.2 质谱条件

电喷雾离子源(ESI)负离子模式;毛细管电压4.0 k V;雾化气流量3.0 L·min-1,加热气流量10.0 L·min-1;加热气温度400 ℃,离子通道管温度250 ℃,离子源温度300 ℃;多反应监测(MRM)扫描模式;其他质谱参数见表1。其中“∗”为定量离子对。

表1 质谱参数Tab.1 MS parameters

1.3 试验方法

土壤样品为现场采集的柱状样品,将其自然风干后缩分,并过孔径为0.25 mm 的筛网。称取上述土壤样品(5±0.01)g于50 mL 聚丙烯离心管中,加入20 mL 水和5 mL 二氯甲烷,以12 000 r·min-1转速高速匀浆1 min,再以10 000 r·min-1的转速离心2 min。取固相萃取小柱,先经过5 mL水和5 mL甲醇活化,再注入上清液3 mL,收集最后1 mL的流出液,过0.22μm 水溶性滤膜,按仪器工作条件测定滤液中的3种目标化合物含量。

2 结果与讨论

2.1 色谱行为

草甘膦、氨甲基膦酸、草铵膦标准溶液的色谱图见图1。

2.2 样品前处理条件的选择

2.2.1 提取剂

由于草铵膦、草甘膦、氨甲基膦酸均为强极性化合物,不溶于大部分有机溶剂,故试验以水-二氯甲烷作为提取剂,其中水可以提取土壤中的3 种目标化合物,二氯甲烷可以去除土壤中的脂溶性杂质。

4.培育了现代文明意识大家遵守的融入机制。老旧散不同于商业社区，一般是由农转非形成的“熟人社区”，通过一系列的举措培育社区居民的现代文明意识，能更好的发挥居民自治的参与率和成功率。通过家风家训的征集活动、孝老爱亲典型人物的评比、“二十四孝”文化墙的布置等，培育居民文明意识，回归最真实的自我；通过义工志愿服务、邻里帮扶济困、社区团队活动等，培育助人自助意识，营造邻里一家亲的和谐氛围；通过法治宣传、法治课堂、社区调解队、义务巡逻等，培育居民法治意识，提高法律素养，确保社区长治久安。

2.2.2 提取方法

试验比较了超声提取、振荡提取和匀浆提取等3种方法对目标化合物的提取率和提取时间的影响,结果表明:当达到相同提取率时,匀浆提取时间最短(1 min)。这是由于在高速匀浆机的转动过程中,固液接触面积较大,可在较短的时间内达到较好的提取效果。因此,试验选择匀浆提取法提取土壤中的目标化合物。

2.2.3 净化方法

Oasis HLB固相萃取小柱采用的填料为亲水亲脂的反相吸附剂,可以有效去除蛋白质、脂肪、色素等物质,在抗生素[20]和激素[21]等测定中应用较广泛。以5.0μg·L-1草铵膦和10.0μg·L-1草甘膦、氨甲基膦酸标准溶液过Oasis HLB 固相萃取小柱,得到草铵膦、草甘膦和氨甲基膦酸的回收率为91.8%～97.3%,说明Oasis HLB 固相萃取小柱对这3种化合物没有保留,可以作为固相萃取净化柱。

按照试验方法分析加标空白样品(草铵膦的加标量为20μg·kg-1,草甘膦和氨甲基膦酸的加标量为40 μg·kg-1),在进行固相萃取时,每隔0.5 mL收集一次流出液。结果表明:2 mL 后流出液中草铵膦、草甘膦和氨甲基膦酸的测定值达到最大。综合考虑,试验确定上清液的进样量为3 mL,只取最后流出的1 mL进样分析。

2.3 色谱条件的选择

试验考察了Waters BEH HILIC 色谱柱、Agilent ZORBAXBS-Aq色谱柱、Dikma Polyamino氨基色谱柱对草铵膦、草甘膦、氨甲基膦酸分离效果的影响。Waters BEH HILIC 色谱柱和 Agilent ZORBAXBS-Aq色谱柱的pH 适用范围较窄,且得到的3种目标化合物的色谱响应不强、峰形较差。Dikma Polyamino氨基色谱柱适用的pH 为2～12,且对3种目标化合物的分离效果较好,峰形尖锐、对称。因此,试验选择Dikma Polyamino氨基色谱柱对3种目标化合物进行分离。

试验还发现,在流动相中添加乙酸铵可以改善目标化合物的峰形,添加氨水可以提高目标化合物的响应值。经过优化,确定的流动相为pH 12 的5 mmol·L-1乙酸铵-氨溶液和乙腈体系,梯度洗脱程序见1.2.1节。