SIGLEC15 在肿瘤微环境及免疫调节中的作用

陈宵铤 关中

中山大学孙逸仙纪念医院耳鼻咽喉头颈外科，广州 510120

肿瘤的发展和进展与周围基质的改变同时发生。肿瘤细胞可以通过分泌各种细胞因子、趋化因子和其他因子来改变其微环境，从而使周围细胞重编程，使它们能够在肿瘤存活和进展中发挥重要作用。免疫细胞是肿瘤微环境的重要组成部分，在肿瘤的发生发展过程中有至关重要的作用。越来越多的证据表明，先天免疫细胞［巨噬细胞、中性粒细胞、树突细胞、先天淋巴细胞、髓源性抑制细胞和自然杀伤细胞（NK 细胞）］以及适应性免疫细胞（T 细胞和B 细胞）均存在于肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）中。肿瘤细胞和周围免疫细胞之间的互相作用最终会促进肿瘤生长和转移。

肿瘤发生发展过程中会产生特定的因子，越来越多的研究发现这些因子可作为肿瘤免疫疗法的新靶标。当肿瘤细胞表达肿瘤抗原时，抗肿瘤免疫周期开始。抗原呈递细胞受到肿瘤抗原的刺激，并将抗原衍生的肽呈递给免疫细胞，从而激活免疫细胞使其在循环中迁移，进入肿瘤部位并杀死肿瘤细胞。肿瘤细胞的死亡诱导了其他肿瘤抗原的释放，从而引发了另一个肿瘤免疫周期［1］。免疫系统具有复杂的负反馈回路，以控制对病原体的免疫反应。肿瘤细胞利用这些负反馈回路逃避抗肿瘤免疫过程。当前的抗肿瘤免疫治疗方法通过一些靶点并利用各种机制激活肿瘤免疫，从而达到杀死肿瘤细胞的目的。

肿瘤免疫周期激活后，效应T 细胞会进入人体全身，渗入肿瘤细胞部位，识别表达主要组织相容性复合物（major histocompatibility complex，MHC）呈递的肿瘤抗原衍生肽的肿瘤细胞，并杀死靶肿瘤细胞。肿瘤细胞的死亡诱导了其他肿瘤抗原的释放，从而通过引发和激活更多的T细胞来识别和攻击肿瘤细胞，进一步增强抗肿瘤免疫反应［2］。在任何免疫反应中，抗肿瘤反应的最终阶段是由刺激性和抑制性辅助途径的复杂网络调节。其中程序性死亡受体1（programmed cell death protein 1，PD-1）/程序性死亡受体-配体1（programmed cell death-ligand 1，PD-L1）途径是主要的抑制途径之一。T 细胞受体（T cell receptor，TCR）与其相关抗原-MHC 复合物的结合，以及细胞因子刺激［例如白细胞介素（IL）-2］，诱导PD-1 的表达。PD-1 与PD-L1 在靶细胞上的结合会抑制T 细胞增殖和IL-2 的产生，从而减弱免疫反应。因此，合理的联合免疫疗法必须协同促进T 细胞活化和效应子功能，并协同拮抗抑制性T细胞。

在TME分类系统中研究肿瘤免疫力可以作为评估抗肿瘤免疫力和确定潜在的肿瘤免疫抵抗机制的第一步。TME分类基于两个主要因素：（1）PD-L1在肿瘤中的表达；（2）免疫细胞浸润的存在，主要是肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocyte，TIL）［3-5］。相应地，TME有4种不同的亚型：T1（PD-L1-TIL-）、T2（PD-L1+TIL+）、T3（PD-L1-TIL+）和T4（PD-L1+TIL-）。目前肿瘤免疫疗法主要有两种方法：（1）增强法，通过增强“正常”抗肿瘤免疫机制从而达到抑制肿瘤发展的目的。这类方法的范围从传统的IL-2信号非特异性增强到最近的肿瘤特异性嵌合抗原受体T 细胞免疫疗法（chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy，CAR-T）。（2）归一化方法，其目的是在TME中恢复有缺陷的抗肿瘤免疫力，包括食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）批准的免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors，ICI）和其他正在开发的药物（例如腺苷途径的抑制剂）［6］。目前在使用ICI 刺激免疫微环境和抗癌免疫反应方面取得的进展改善了患者的治疗结果。然而，原发性和获得性耐药显著降低了ICI的成功率，只有少数患者受益于目前可用的癌症免疫疗法。

在肿瘤发生过程中，肿瘤细胞呈现特定的碳水化合物链，这是癌症免疫治疗的新靶点。虽然这些肿瘤相关碳水化合物（tumor-associated carbohydrates，TACA）可以通过抗体和疫苗接种方法靶向识别，但包括唾液酸聚糖在内的TACA 能够通过与白细胞上的免疫受体结合来抑制抗肿瘤免疫反应。唾液酸主要存在于与蛋白质或糖脂相连的N-连接和O-连接聚糖的非还原端。唾液酸化过度促进其与唾液酸结合受体［如选择素和唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素（sialic acid-binding Ig-like lectins，SIGLECS）］的相互作用，从而促进癌症进展。一系列称为SIGLECS 的唾液酸识别蛋白（唾液酸+免疫球蛋白超家族+凝集素的缩写）可在各种白细胞上表达，通过其细胞外结构域的配体及介导细胞内结构域的信号转导来调节免疫应答［7］。大多数SIGLECS 与蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-1相互作用以抑制细胞活化，而小部分SIGLECS 通过衔接蛋白DAP12（由TYROBP基因编码）和酪氨酸激酶（SYK）发出信号，从而激活并使其表达。其中，SIGLEC15 属于具有后者作用的亚家族成员。多个研究表明，SIGLEC15 在破骨细胞分化中具有重要作用，而最近其在肿瘤和微生物感染中的潜在作用也引起了研究者们的注意。本综述将简要总结目前与SIGLEC15 的生物学功能有关的工作，旨在为通过化学生物学方法鉴定SIGLEC15配体的研究提供理论基础。

1 SIGLEC15分子性质及其在肿瘤免疫中的作用

2001 年Angata 等［8］首次报道了与SIGLEC15 的N 末端免疫球蛋白样结构域相对应的人类基因组DNA 序列。SIGLEC15 具有由两个免疫球蛋白样结构域组成的细胞外结构域，其后是一个跨膜结构域，其中包含一个赖氨酸残基（人SIGLEC15中的Lys274），它是与衔接子蛋白DAP12相互作用所必需的。DAP12 的细胞外结构域非常短（少于20 个氨基酸），其后是跨膜结构域，其中包含天冬氨酸残基（人DAP12 中为Asp50），胞质尾部包含称为免疫受体酪氨酸的活化基序（immunoreceptor tyrosine activation motif，ITAM）的序列基序，磷酸化后募集SYK。SIGLEC15与DAP12之间的相互作用是基于跨膜结构域上的离子键，类似于许多其他与DAP12相关的受体。

尽管研究中具有作用的聚糖结构非常有限，但有研究表明SIGLEC15优先结合唾液酸Tn（Neu5Acα2-6GalNAcα1）结构［9］。人SIGLEC15的聚糖结合活性远弱于小鼠SIGLEC15的聚糖结合活性。SIGLEC15与衔接蛋白DAP12相关，并且在人工实验系统中也显示与另一衔接蛋白DAP10 弱相互作用；然而，后者发现的体内相关性尚不清楚。SIGLEC15 在人脾脏和淋巴结中表达DC-SIGN 的细胞子集中表达。这些发现表明SIGLEC15 可能在髓样细胞中起作用，但是SIGLEC15的体内作用尚不清楚。

既往研究表明，与肿瘤相关的糖基化可以通过与聚糖结合受体（也称为凝集素）结合而直接影响抗肿瘤免疫力［10］。在各种类型的肿瘤中均发现了高唾液酸化的聚糖结构［11-12］。某些肿瘤细胞上的唾液聚糖可与抑制性唾液酸结合受体SIGLECS结合［13-14］。SIGLECS属于免疫球蛋白（I）型凝集素家族［15］。在人类中，有14 种具有功能活性的SIGLECS 受体。一方面，存在进化保守的SIGLECS 受体，包括SIGLEC-1、SIGLEC-2（CD22）、SIGLEC-4 和SIGLEC15。另一方面，与CD33相关的SIGLECS也已在哺乳动物内迅速进化。SIGLEC-3 （CD33）、SIGLEC-5、SIGLEC-6、SIGLEC-7、SIGLEC-8、SIGLEC-9、SIGLEC-10、SIGLEC-11 和SIGLEC-14 属于CD33 相关的SIGLECS，对于它们中的大多数而言，它们在小鼠和人类中没有直系同源物。大多数SIGLECS受体的细胞内结构域均含有基于免疫受体酪氨酸的抑制性基序（immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif，ITIM）或类似ITIM 的图案。这些抑制受体的参与导致含有Src 同源区域的磷酸酶（SHP）-1 和SHP-2 的磷酸化，从而抑制细胞活化。大多数SIGLECS 受体在免疫细胞上表达，从而参与抑制免疫细胞的活化。CD33 相关SIGLECS 的多样化可能是由于与病原菌的相互作用，这些病原体利用唾液聚糖覆盖了抑制性SIGLECS 受体，从而利用抑制性SIGLECS受体［16］抑制细胞活化。

SIGLECS 受体作为新的靶向免疫检查点的作用最近得到了深入的研究。先天免疫细胞上抑制性SIGLECS受体的表达与抗肿瘤免疫有关。SIGLEC-7 在肿瘤细胞上表达。大多数NK 细胞和SIGLEC-9 可以在NK 细胞的某些亚群中找到。唾液聚糖在肿瘤细胞内的上调可以通过与SIGLEC-7 以及在某些情况下与SIGLEC-9［17］结合来抑制NK 细胞介导的肿瘤细胞杀伤。已有研究发现SIGLEC-9的表达使巨噬细胞极化偏向于致瘤性表型，并在巨噬细胞上增加了PD-L1的表达［18］。在此实验组中，SIGLEC-9的参与依赖于STn 修饰的粘蛋白。小鼠中的其他实验表明，髓系极化受抑制性SIGLECS 受体的影响，包括SIGLEC-E（SIGLEC-9在小鼠中的功能旁系同源物）［19］。

SIGLECS 在包括CD8+T 细胞在内的适应性免疫细胞上的表达抑制有效的抗肿瘤免疫。SIGLEC-9 在包括非小细胞肺癌（non small cell lung cancer，NSCLC）、结肠直肠肿瘤、上皮性卵巢肿瘤和黑色素瘤在内的多种肿瘤中的肿瘤浸润T细胞上调［20］。在T细胞上过表达SIGLEC-9的转基因小鼠模型中，肿瘤生长显著增强。SIGLEC-9主要在肿瘤特异性T细胞上表达，表现为浸润肿瘤的CD8+T细胞中的TCR成分减少［21］。SIGLEC-9 阳性CD8+T 细胞代表功能障碍的肿瘤内T细胞亚型，而SIGLEC-9阻断剂可以使其重新激活。

SIGLEC15 可识别的唾液酸-Tn 结构，是一种众所周知的与肿瘤相关的碳水化合物抗原。巨噬细胞在肿瘤免疫中起着主要作用［22］，SIGLEC15 在肿瘤相关的巨噬细胞上表达，并在TME 中起作用。有研究发现SIGLEC15 由巨噬细胞集落刺激因子（macrophagocyte colony stimulating factor，M-CSF）诱导，并在与肿瘤相关的巨噬细胞上表达［23］。唾液酸Tn+肿瘤细胞系与M-CSF 诱导的人类巨噬细胞或SIGLEC15+骨髓细胞系的共培养可增强髓样细胞转化生长因子（TGF）-β 的产生，这取决于DAP12 和SYK 蛋白的表达。这些发现表明，SIGLEC15 可能在TME 中起作用，但尚需进一步行体内实验进行验证。

一项研究揭示了SIGLEC15在肿瘤中的作用［24］，他们发现，SIGLEC15 蛋白在体外可抑制T 细胞增殖和活化，这一点已在体内使用SIGLEC15 敲除小鼠进行了验证。T 细胞抑制依赖于IL-10，但目前IL-10 是由髓样细胞还是由T 细胞产生的尚未可知。他们还发现，SIGLEC15 在非小细胞肺肿瘤临床样本中的肿瘤细胞和/或与肿瘤相关的基质细胞（包括与肿瘤相关的巨噬细胞）上表达，而其与PD-L1 的表达互斥。在小鼠黑素瘤模型中，SIGLEC15 缺乏促进T 细胞反应，因此具有更好的肿瘤控制和总体生存。在野生型小鼠中用单克隆抗体靶向SIGLEC15 可以逆转T 细胞的抑制作用，从而减弱肿瘤的生长［24］。值得注意的是，尽管SIGLEC15 与免疫调节分子的“B7 家族”没有特别紧密的相似性，但SIGLEC15 的表达［被干扰素-γ（IFN-γ）抑制］与PD-L1 的表达负相关（后者被诱导）。这表明靶向SIGLEC15治疗可能是针对PD-1/PD-L1难以进行靶向治疗的肿瘤患者的希望。

近年来，肿瘤免疫学在概念上的重要进展是TME 中存在适应性耐药机制，以防止执行肿瘤免疫。例如，B7-H1（CD274，PD-L1）可选择性地在TME 中被诱导，主要是由肿瘤浸润性T 淋巴细胞中的IFN-γ 引起，这又引发了一系列事件，包括PD-1 与T 细胞的结合，细胞凋亡的传递和衰竭信号，这最终导致T细胞的功能障碍［25］。在TME中，SIGLEC15（在肿瘤细胞或基质细胞上）与其在T 细胞上的“受体”之间的相互作用是否需要唾液酸是一个悬而未决的问题。在这方面，有关巨噬细胞通过CD24和SIGLEC-10之间的相互作用（分别针对肿瘤细胞和与肿瘤相关的巨噬细胞）抑制肿瘤细胞吞噬作用的最新报道可能提供了理论基础。这项研究表明，CD24-SIGLEC-10 相互作用显然不需要唾液酸，而从肿瘤细胞中除去唾液酸也可增强巨噬细胞的吞噬能力，而与CD24无关［26］。因此，通过蛋白质-蛋白质相互作用实现不依赖聚糖的SIGLECS功能是可能的。

2 SIGLEC15配体

Takahata 等［27］的研究小组在发现SIGLEC15 之前就证明了唾液酸参与破骨细胞的分化。Chang 等［28］开发了一种使用酪酰胺自由基化原理将生物素标记引入SIGLECS的蛋白配体中的方法。简而言之，将表达SIGLEC15配体的细胞与过氧化物酶偶联的重组SIGLEC15探针孵育，该探针会生成短寿命的生物素-酪酰胺自由基，该自由基与附近的酪氨酸残基反应以产生稳定的加合物。使用这种方法，研究确定CD44（一种高度糖基化的蛋白质）是RAW264.7 细胞上SIGLEC15 的配体。在RAW264.7 细胞中敲除CD44 减少SIGLEC15 结合并减弱细胞融合。这一发现还表明CD44 可能是SIGLEC15 的肿瘤细胞相关配体，因为CD44 在许多类型的实体瘤中高度表达［29］。但是，在TME 中，CD44 是否作为SIGLEC15 的T 细胞配体（或更确切地说是“受体”）从而起作用尚未可知，所以需要进一步深入的研究来探讨其作用。

如上所述，尽管唾液酸基Tn 是SIGLEC15 的优选配体，但该研究中使用的聚糖探针受到限制。据报道，类似这些寡糖的唾液酸化和硫酸化的寡糖配体（Neu5Acα 2-3-3［HSO3-6］Galβ1-4GlcNAcβ1）是SIGLEC15 的优选配体，并且这种结构可能存在于软骨中的硫酸角质素上［30］。测试该唾液酸化的和硫酸化的聚糖结构是否被SIGLEC15 识别具有重要意义。然而，目前仍未完全理解SIGLEC15所优先识别的生物学相关聚糖的确切结构。

Macauley 和Wu 也用一种名为“基于细胞的聚糖阵列”的新方法来寻找SIGLEC15 优先识别的聚糖。他们通过唾液酸转移酶（ST6Gal-1 或ST3Gal-Ⅳ）将具有炔基的唾液酸衍生物（即被N-炔丙氧基羰基取代的C5-）引入唾液酸缺陷型细胞系的细胞表面糖缀合物中［31］。通过点击化学，唾液酸结构通过带有叠氮化物基团的小型化学化合物的库而多样化。他们发现一些唾液酸衍生物是SIGLEC15 的配体。这些研究在一起证明了化学生物学如何指导SIGLEC15 的特异性和高亲和力抑制剂的发现。进一步研究以鉴定SIGLEC15 优先识别的聚糖结构，以及此类聚糖的结构多样化，再结合结构-活性关系分析，最终可能会产生具有翻译潜力的有效SIGLEC15抑制剂。

3 总 结

研究表明，SIGLEC15在TME中具有生物学作用。尽管尚不清楚SIGLEC15调节抗肿瘤免疫的确切机制，但已发表的数据表明SIGLEC15 可能与T 细胞上的某些蛋白质“受体”结合并抑制T 细胞反应。未来的研究显示使用化学生物学工具揭示SIGLEC15 的T 细胞上的相互作用伴侣，将进一步增进我们对SIGLEC15的作用原理的了解，并且增加通过利用这些知识从而取得治疗获益。