弓形虫毒力因子ROP18研究进展

刘俊 孙涛

1邵阳学院附属第一医院检验科，湖南 422000；2湖南省邵阳市中心医院血液肿瘤实验室 422000

弓形虫有性生殖只存在于猫科动物的宿主体内，但由于家鼠在世界范围内分布广泛，并与家猫共生，它们也可能是弓形虫的重要中间宿主［1］，一些弓形虫菌株对实验室小鼠表现出高致病性。为了保护纳虫空泡膜（parasitophorous vacuole membrane，PVM）的完整性，弓形虫进化出了几种多态效应蛋白，不同的多态性蛋白质对免疫耐受系统的抑制起重要作用［2］。弓形虫Ⅰ型强毒株的棒状体蛋白18（ROP18）核苷酸结合位点高度保守区域具有苏氨酸激酶催化活性。某些弓形虫Ⅱ型无毒株也表达了ROP18的毒性等位基因型［3］，但其PVM的免疫相关GTP酶（IRG）未能积累到感染小鼠细胞的程度。宿主和病原体之间相互施加选择压力，导致种群遗传结构的动态变化和共同进化的变化，这些变化有助于增强病原体的毒力和宿主抗性，有研究预测，许多蛋白质序列的多态性变化将支持产生这种相互作用。对涉及宿主抗性和病原体毒力的这些多态性分子进行了解并对其功能机制进行分析，对疾病控制具有潜在的重要意义。本文综述分析了弓形虫分泌的重要的毒力因子ROP18的相关特性。

1 ROP18与ROP5的相互作用

虽然没有发现弓形虫ROP5的特异性功能，但有研究报道了ROP5与ROP18的相互作用可以提高ROP18的活性来增强弓形虫的毒力［4-5］。ROP5基因座由一群密集重复的基因组成，编码3种不同的ROP5亚型，ROP5a、ROP5b和ROP5c，每一种弓形虫病原体株中都包含多种亚型［6］。这些ROP5基因的单个序列几乎是相同的，但在弓形虫Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型株间表达差异很大。ROP5和ROP18通过磷酸化核苷酸结合位点——高度保守的苏氨酸残基来抑制IRG抗性系统。在这些文献研究中，发现致密颗粒蛋白7（GRA7）与ROP5直接相关，并且对于干扰素诱导产生的GTP酶（IFN-γ-inducible GTPase6，IRGa6）的有效磷酸化必不可少［7-9］。因此，GRA7的丢失与否可能与体内寄生虫的毒力直接相关。有研究表明GRA7是一种非免疫特异性弓形虫效应物，并提出了一种通过调节ROP18激酶活性来解释GRA7分子功能的模型，此模型还发现IRGa6也是IRG蛋白中ROP18唯一的特异性靶标［10］。ROP18对体内IRGa6特异性功能表明，可能还存在某些其他未知的弓形虫毒力效应物可能对其他IRG蛋白具有严格的特异性。

2 ROP18通过磷酸化GTPases蛋白作用免疫逃逸

在寄生虫入侵的过程中，弓形虫通过分泌一些特殊的物质将毒力决定因子传递到宿主细胞中。ROP18的决定簇是一种多态性丝氨酸/苏氨酸激酶，它能磷酸化宿主目标细胞，调节虫体毒性［11］。随着分泌物进入宿主细胞，ROP18转运到PVM上，并与宿主-病原体界面的细胞膜相连。但是，ROP18-PVM关联的功能机制尚不清楚。在某些研究文献中，发现ROP18突变体在激酶结构域上游富含精氨酸的结构域改变后，不再与PVM结合［12］。在感染期间，宿主细胞上调免疫相关的GTP酶蛋白，定位并破坏寄生虫周围的PVM。ROP18通过磷酸化关键的GTP酶蛋白结构域的免疫反应基因来逃逸宿主的先天免疫通路［13-14］。ROP18的靶向突变体不能磷酸化IRGa6并且无法将IRGs从PVM转移，尽管保留了内在的激酶活性，但这些突变体在小鼠急性弓形虫病模型中是无毒的。因此，ROP18与PVM的关联可能是由其富含精氨酸的N端结构域介导的，且对其作为毒力决定因子的功能至关重要。

3 ROP18对宿主细胞转录影响

为了进一步加深对ROP18分子功能的理解，有学者研究了人胚肾细胞（HEK-293T）中弓形虫RH株ROP18的转录反应。通过RNA测序，研究比较了HEK-293T细胞的ROP18转录组对HEK-293T细胞的作用［15］。分析发现，ROP18改变了HEK-293T细胞中750个基因（467个上调基因和283个下调基因）的表达。基因本体论和病理富集分析表明，差异表达基因在细胞外间质和免疫相关通路中显著富集［16］。富集分析显示DEGs参与多种疾病相关的通路，如神经系统疾病和眼病［17］。ROP18显著增加了“保留内含子”的选择性剪接模式，改变了144转录因子（TFs）的表达。这些发现为研究ROP18如何通过改变基因、TFs和通路来影响宿主细胞的生物学过程提供了新的视角。ROP18在基因转录水平上对细胞周期过程没有明显的影响［18］。然而，另一个效应蛋白ROP16在宿主细胞周期中发挥了重要作用［19-20］。这2种毒力相关蛋白（ROP16和ROP18）对宿主细胞周期影响的差异可能是由于其宿主靶基因的差异。在之前的研究中，发现Rh菌株的ROP18与492个宿主蛋白相互作用［21］。在研究中，发现只有少数几个相互作用的蛋白表达水平显著改变。这种差异可能归因于转染的宿主细胞行为的变化。ROP17和ROP18都是ROP2家族的分泌蛋白，在宿主细胞中有相似的位置。通过比较宿主中ROP17和ROP18的转录反应，发现与ROP17和ROP18相关分别有110个和276个表达降低或增加的基因［22］。这种在宿主细胞内的位置以及对宿主细胞转录组的影响上的相似性与ROP17和ROP18共享一些宿主细胞靶点的事实相一致。ROP5与ROP18和ROP17形成复合物，介导弓形虫在小鼠体内的存活。鉴于ROP18的功能相互作用和重叠，研究ROP5、ROP16、ROP17、ROP18同时表达对宿主细胞转录重编程的影响，可以提高对刚地弓形虫毒力机制的认识。有研究分析了HEK-239T细胞对ROP18表达的转录组反应，研究发现，ROP18对宿主基因的表达有显著影响，其中有750个基因表达上调，467个基因表达上调，283个基因表达下调［23］。主要涉及显著改变的基因的功能在细胞外基质组织、免疫反应和疾病过程中。进一步研究ROP18的催化活性突变体对细胞转录的影响，并使用不同的细胞系，可进一步了解和明确弓形虫与宿主细胞过程相互作用的机制。

4 结 论

弓形虫可以说是最成功的专性细胞内寄生虫之一。一旦受污染的食物或水中含有感染性卵囊或速殖子，就会感染各种温血脊椎动物。据报道，全世界大约有1/3的人口感染这种寄生虫，不同国家的感染率不同。在被感染的人中，大多数人由于强大的免疫功能控制，表现出轻微或无明显症状。然而，对于孕妇和免疫系统受损的个体，如艾滋病、癌症化疗和移植，弓形虫感染可能导致严重的健康问题。在寄生虫感染的疾病中，先天性弓形虫病被报道为最严重的疾病之一，每10 000个活产儿中有1～15个发病。通常，先天性弓形虫病有不同的症状，包括脑积水或小头畸形，脑内钙化和脉络膜视网膜炎等。

已知分泌的ROP18在寄生虫虫体主动进入宿主细胞并最终操纵宿主细胞以满足其需要方面发挥重要作用。在这些分泌的蛋白中，ROP18被认为是能够影响宿主细胞功能的关键毒力因子。它在弓形虫Ⅰ型和Ⅱ型菌株中高度表达，作用于PVM。据报道ROP18能磷酸化其他ROP蛋白（即ROP2、ROP4和ROP8），并与其他宿主细胞蛋白相互作用。例如，它通过激活转录因子6和p65来抑制宿主的天然免疫和适应性免疫反应，从而达到免疫逃逸的目的。尽管人们对ROP18介导的通过免疫逃逸而产生毒力的机制进行了深入的研究，但这种激酶在宿主细胞中发挥致病作用的确切分子机制仍不清楚，我们下一步工作可针对ROP18对宿主细胞凋亡的影响继续展开更加深入的研究。