TLRs在1型糖尿病胰岛β细胞损伤中作用的研究进展

陈换换，宋超杰，唐 聪(综述)，张小莉(审校)

1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus,T1DM)是一种慢性自身免疫性疾病，由自身抗原导致产生胰岛素的β细胞严重损伤。T1DM是儿童糖尿病的主要类型，根据国际糖尿病联盟(International Diabetes Federation,IDF)最新统计[1]，2019年全球约有110万20岁以下青少年和儿童患有T1DM。T1DM有许多并发症，如糖尿病酮症酸中毒、视网膜病变、糖尿病肾病等。其具体发病机制尚未完全了解，可能的解释是遗传易感性与环境因素的结合引发自身免疫反应，最终导致T1DM功能性β细胞量减少和高血糖症。先天性免疫和适应性免疫都参与了T1DM的发生发展，Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)是先天性免疫的重要参与者，TLRs的主要功能是诱导炎症反应并建立适应性免疫,能参与自身免疫性疾病[2]。T1DM的典型病理变化是胰岛炎，目前TLRs在T1DM自身免疫诱导的胰岛β细胞损伤的作用已经引起了广泛的关注和研究，本文就TLRs介导的信号转导过程与T1DM发生发展过程中胰岛β细胞损伤进行综述，旨在为T1DM的防治提供理论依据。

1 T1DM炎症反应与胰岛β细胞损伤

T1DM的病理特征是胰岛炎症，身体的免疫系统攻击胰岛β细胞，在胰岛周围和胰岛实质内观察到炎症细胞，导致胰岛β细胞的破坏。有研究[3]表明，T1DM中首先由β细胞触发的反应是抗病毒反应、模式识别受体激活、蛋白修饰和主要组织相容性复合体Ⅰ类抗原提呈。在胰腺炎的晚期阶段，T细胞的募集和激活以及β细胞试图通过激活抗炎通路(即IL-10、IL-4/13)和免疫检查点蛋白来保护自身占主导地位。Bulek等[4]研究表明CD8+T细胞通过自身反应的T细胞受体1E6识别人类白细胞抗原HLA-A*0201限制性葡萄糖敏感胰岛素原多肽，刚性的“锁和钥匙”结合支撑了1E6-HLA-A*0201-肽的相互作用，从而杀死T1DM患者的胰岛β细胞。细胞因子是免疫和炎症过程的重要调节剂，胰腺内免疫细胞释放的特定细胞因子如IL-1β和TNF-α通过直接引起β细胞损伤而促进T1DM[5]。而且在最近发作的T1DM中，TNF-α水平与残余胰岛β细胞功能相关，并可作为疾病缓解和进展的预后生物标志物[6]。TLRs相关的先天免疫反应可调节T细胞及相关炎症因子，加剧T1DM的胰岛β细胞损伤。例如，TLR9激活可通过增加IFN-α的水平，促进CD8+T细胞激活从而促进非肥胖型糖尿病(non-obese diabetic,NOD)小鼠胰岛炎，有助于NOD小鼠糖尿病的自发发作[7]。

2 TLRs

2.1TLRs信号转导 TLRs是一种模式识别受体，在启动对微生物的固有免疫反应以抵抗感染和维持体内平衡方面起着至关重要的作用。目前，已在小鼠中鉴定出12种TLR(TLR1-TLR9和TLR11-TLR13)，在人类中鉴定出10种TLR(TLR1-TLR10)。其中TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6和TLR10位于细胞表面，而TLR3、TLR7、TLR8和TLR9位于细胞内体中。TLRs信号转导途径的激活将导致一系列下游信号事件，从而导致转录因子的激活，最终释放各种促炎性细胞因子，趋化因子和干扰素并激活适应性免疫系统。TLRs家族的信号转导方式主要有两种:一种是髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)依赖型TLRs信号转导通路；另一种是诱导干扰素β的含TIR结构域衔接蛋白(TIR-domain-containing adapter inducing IFN-β，TRIF)依赖型信号转导通路。除TLR3外，所有TLRs均可激活MyD88依赖型途径。TLR2和TLR4募集一个类似MyD88的衔接分子Mal，核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)二聚体通过非共价键的形式与其抑制蛋白(inhibitor of NF-κB，IκB)结合而分散在细胞质内，通过IκB激酶复合体激活NF-κB。然后，NF-κB易位至细胞核，转录、产生和释放炎性细胞因子(如TNF-α、IL-1β和IL-6)。TLR3通过TRIF激活干扰素调节因子3(interferon regulatory factor 3，IRF3)。IRF3发生二聚化并转移到细胞核中，并与干扰素刺激应答元件(interferon-stimulated response element，ISRE)基序结合，促进IFN-α/β的表达。TLR4还可以利用TRIF相关接头分子(TRIF-related adaptor molecule，TRAM)激活NF-κB和IRF3。另一方面，TLR9也可以激活IRF3相关分子，如IRF7，从而导致IFN-α/β的表达。

2.2TLRs与炎症反应 TLRs的主要功能是诱导炎症反应，TLRs激活组织驻留的巨噬细胞以产生促炎性细胞因子，可协调局部和全身性炎症反应。通过细胞因子激活周围的细胞以产生趋化因子或黏附分子，从而将数个炎症细胞募集到炎症部位。招募的巨噬细胞或中性粒细胞被激活，并通过内化模式识别受体(pattern recognition receptor,PRR)摄入入侵的病原体。之后，这些细胞通过产生一氧化氮、活性氧或防御素来杀死病原体[8-9]。

3 TLRs与T1DM

TLRs信号转导在T1DM的发展中起关键作用，T1DM动物模型和人体研究表明，胰岛细胞(包括分泌胰岛素的β细胞)能表达所有的TLRs，并且它们与病原体衍生的配体的结合显著增强了促炎性趋化因子的产生。近年来，TLR2-4和TLR9与T1DM的关系研究较多，引起国内外学者的关注，为T1DM的治疗寻找新的突破点。

3.1TLR2与T1DM TLR2可以识别多种微生物来源的成分和某些内源性配体。TLR2的配体包括细菌的脂蛋白、脂多肽、脂壁酸、阿拉伯甘聚糖及酵母多糖等。有研究[10]表明，TLR2信号转导在自身免疫性疾病中起重要作用，与对照组相比，T1DM患者TLR2在单核细胞亚群中表达异质性及其在经典单核细胞中明显上调，且与T1DM的持续时间呈正相关。链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠随着自身病程的进展，免疫功能状态发生改变[11]，与野生型(wild type,WT)小鼠相比，链脲佐菌素诱导的T1DM小鼠中巨噬细胞TLR2表达和MyD88依赖性信号转导增加，增强炎症反应[12]。有研究[13]表明，凋亡的β细胞通过TLR2依赖性抗原呈递细胞(antigen presenting cell,APC)的激活以及炎性细胞因子和趋化因子的产生，从而引发自身反应性T细胞，促进T1DM发生发展。在TLR2缺陷的NOD小鼠中，致糖尿病性T细胞的启动和自身免疫性糖尿病的发展受到显著抑制，这表明TLR2对于调节T细胞反应和疾病的发展起重要作用[14]。这些研究表明，β细胞损伤及其通过TLR2的转导可能是刺激APC和自身免疫级联反应导致糖尿病临床发作的重要事件。

3.2TLR3与T1DM TLR3基因编码识别双链核糖核酸(double-stranded RNA,dsRNA)的PRR家族的内质受体，在病毒感染触发的先天免疫应答中起重要作用。与其他TLR配体不同，TLR3信号转导通过不依赖MyD88的途径发生。研究[15]表明，TLR3在病毒诱导的T1DM中可能发挥作用。TLR3对雌性NOD小鼠中柯萨奇病毒B4(Coxsackievirus B4,CVB4)诱导的T细胞介导的胰岛炎至关重要，在CVB4感染的WT NOD小鼠胰岛中T细胞丰富，β细胞损伤严重，加速病毒诱导的T1DM进程。TLR3是已知的识别病毒成分并诱导1型干扰素用于抗病毒防御的基因，暴发型T1DM发病后不久胰腺中表达多种TLR，尤其是TLR3和肠道病毒RNA的表达明显上调[16]。胞内和胞外dsRNA均可与TLR3结合，触发促炎细胞因子和趋化因子的产生，通过激活NF-κB和IRF-3导致β细胞凋亡[17]。研究[18]表明由肠病毒感染触发的暴发型T1DM中，渗透到胰岛的单核细胞中TLR3的表达增加，β细胞中的维甲酸诱导型基因I(retinoic acid-induced gene I,RIG-I)样受体和黑素瘤分化相关基因5(melanoma differentiation-associated gene 5,MDA5)表达强烈上调，胰岛Treg细胞表达缺失，IFN-γ诱导因子IL-18广泛表达，先天免疫力与适应性免疫力一起加速了暴发性T1DM患者的β细胞死亡。以上研究表明，TLR3在病毒感染触发的T1DM中起重要作用。

3.3TLR4与T1DM TLR4多在单核细胞中广泛表达，可以结合革兰阴性细菌细胞壁成分脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),LPS是革兰阴性细菌外膜的重要结构成分，并且已成为细菌研究最多的刺激成分之一。LPS与TLR4结合，通过MyD88依赖性和TRIF依赖性途径启动免疫应答的级联反应，以诱导1型干扰素和促炎性细胞因子(如IL-1β和TNF-α)的产生。TLR4参与了自身免疫性疾病，例如小鼠关节炎模型和实验性变态反应性脑脊髓炎。最近，TLR4也被证实在T1DM的发展过程中参与了促炎状态和胰岛内β细胞的自身免疫破坏。越来越多的证据表明，在T1DM患者和动物中发现了TLR信号失调。临床研究[19]发现，与健康个体比，T1DM患者TLR4基因表达水平显著上调。TLR4的转导增强NF-κB信号的活性并增加促炎细胞因子的分泌。Devaraj等[20]研究发现与对照组相比，T1DM单核细胞TLR4表面表达及mRNA均显著增加，并且TLR4的下游靶标MyD88、NF-κB的表达显著上调，炎症细胞因子IL-1β和TNF-α的释放增加且与TLR4的表达相关。现有研究[21]显示，TLR4是β细胞的主要受体，在自身免疫性糖尿病的发展过程中，通过TLR4信号通路选择性地损伤β细胞而不是α细胞。以上研究表明，TLR4信号转导与T1DM胰岛β细胞的损伤有关。

3.4TLR9与T1DM TLR9能识别微生物核酸，特别是CpG基序，激活B淋巴细胞和APC的免疫刺激特性，并且信号通过MyD88途径发生，进而激活适应性免疫系统。TLR9表达于不同的免疫细胞，包括巨噬细胞、树突状细胞(dendritic cells,DC)、B细胞和T细胞，但高度免疫表达于浆细胞样DC(plasmacytoid dendritic cells,pDC)。目前，越来越多的证据表明TLR9在T1DM的发生发展中起作用。郑超等[22]发现人工合成的病毒模拟物未甲基化寡聚脱氧核苷酸CpG-ODN可通过激活天然免疫的TLR9/MyD88通路引起系统性或局部炎症，继而影响到获得性免疫中Th1/Th2的平衡，破坏胰岛细胞，最终诱导T1DM发病。TLR9激活pDC并增加IFN-α的分泌，进一步损伤胰腺β细胞，导致NOD小鼠糖尿病早期发生发展[23]。目前研究证明TLR9-/-NOD小鼠受到显著保护，免受T1DM的侵害。CD73在糖尿病保护中起着重要作用，在TLR9缺失的情况下，NY8.3 NOD雄性小鼠的糖耐量显著高于WT小鼠，显著增强外周淋巴组织中CD73+T细胞的免疫抑制功能，NOD小鼠的β细胞功能得到了改善[24]。仅次于pDC，TLR9在B细胞中也高度表达。TLR9信号转导介导的B细胞稳态的改变有助于T1DM的发病机理[25]。糖尿病患者B细胞中TLR功能的改变可通过两种机制增加炎症：促炎性IL-8升高和抗炎性IL-10产生不足[26]。TLR9缺陷型B细胞对先天免疫和适应性免疫刺激均反应低下，Sha等[27]研究发现B细胞中的TLR9通过改变产生IL-10的B细胞的频率和功能，导致NOD小鼠免受T1DM的攻击。因此，TLR9可能成为人类T1DM免疫治疗干预的重要有效靶点。作为先天免疫的重要组成部分，TLRs是连接先天免疫和适应性免疫的重要纽扣。胰岛细胞能表达TLR2-4、TLR9，被认为与包括T1DM在内的自身免疫疾病的发病机理有关，NOD小鼠和大鼠模型研究以及T1DM患者中TLRs表达研究的结果均支持该观点，但其具体机制仍有待进一步研究。

4 T1DM发生过程中的肠道菌群参与TLRs信号转导

肠道微生物除了能维持胃肠道的完整性和功能外，其结构和数目的改变还可刺激TLRs，促发其下游通路，发挥促炎作用，促进各种炎症的发生。越来越多的研究表明，肠道菌群参与T1DM的发生发展过程，T1DM中存在益生菌丰度下降、有害菌丰度上升的现象。Henschel等[28]通过调节胃肠道微生物区系，例如增加厚壁菌/拟杆菌的比例，增加乳酸菌和丁酸产生菌的相对丰度，使与自身免疫性糖尿病易感性相关的TLR4活性水平、细胞因子水平、促炎性胰岛转录组和β细胞趋化因子表达正常化，降低T1DM发病率。TRIF是TLR3和TLR4信号下游的重要衔接子蛋白，有研究数据表明，TRIF缺乏可通过改变肠道菌群(变形杆菌的相对丰度显著降低)和降低免疫细胞的促炎表型和功能来保护NOD小鼠免于发展为糖尿病[29]。肠道菌群DNA通过TLR9参与肠道动态平衡，Hall等[30]研究表明TLR9-/-小鼠显示肠道效应位点内CD4+Foxp3+调节性T细胞的频率增加，而产生IL-17和IFN-γ的效应T(Teff)细胞减少，肠道菌群DNA在体外限制了固有层DC诱导的Treg细胞转化。上述研究表明T1DM发生发展过程中改变肠道菌群可通过TLRs信号转导影响疾病的发展进程，为干预肠道菌群预防或逆转T1DM提供有前途的治疗策略。

5 TLRs治疗T1DM的相关进展

TLRs信号转导过程为T1DM免疫治疗提供了多个潜在的治疗靶点。寡聚脱氧核苷酸和氯喹是TLR9的拮抗剂，在NOD小鼠模型中使用TLR9拮抗剂寡聚脱氧核苷酸或氯喹抑制了骨髓衍生的DC激活和CD8+T细胞的激活，延迟NOD小鼠自身免疫性糖尿病[7]。同时氯喹阻断TLR9可改善雄性和雌性NOD小鼠的β细胞功能，并显著减轻其胰岛素炎症[24]。高迁移率族蛋白B1(high-mobility group-B1,HMGB1)是一种核内蛋白，与组蛋白结合，在炎症期间帮助“打开”核小体，使基因启动子与促炎转录因子如INF-β和RNA聚合酶Ⅱ结合，启动转录。此外，HMGB1在组织间隙和血浆中释放可通过与TLRs结合起到促炎细胞因子的作用。Dandona等[31]通过抑制HMGB1可抑制促炎转录因子的作用和促炎基因的转录，同时抑制HMGB1的血浆浓度可通过TLR2和TLR4抑制其促炎细胞因子作用。a1-抗胰蛋白酶(a1-antitrypsin,AAT)是一种蛋白酶抑制剂，通常由肝细胞和单核吞噬细胞产生，能抑制感染和炎症。研究[32]表明AAT可抑制TLR2和TLR4的表面表达，下调单核细胞和髓系树突状细胞中TLRs诱导的促炎反应，降低血清IL-1β水平，改善部分近期发作T1DM患者的胰岛β细胞功能。

6 结语

目前T1DM的发病机制尚未完全明确，但随着发生率越来越高，有效的预防以及寻找治疗靶点已经成为当下研究的热点。临床上通常给予胰岛素来调节血糖，但是外源提供的胰岛素不能像内源性胰岛素一样精确地调节血糖。目前胰岛移植已被认为是一种有前途的替代治疗方法，但需要持续免疫抑制，加上大多数患者由于自身免疫/同种异体免疫排斥，代谢应激和免疫抑制的细胞毒性作用而导致胰岛移植功能逐渐丧失。TLRs家族是一类古老的受体家族，在固有免疫中发挥重要作用，同时与适应性免疫和某些自身免疫性疾病的致病机制密切相关。本文综述了TLRs在T1DM胰岛β细胞损伤中的作用机制，并指出TLRs的表达也可能受肠道微生物的影响，进而促进T1DM的发生发展。目前随着TLRs在T1DM中的不断挖掘，极有可能成为T1DM发生机制的一个突破口，为研发防治T1DM的新药物提供理论依据。