蛋白质力学稳定性的测定方法在食品领域的研究进展

吴琪，仪淑敏*，李学鹏，谢晶，季广仁，励建荣

1.渤海大学食品科学与工程学院，辽宁省食品安全重点实验室，生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心（锦州 121013）；2.上海海洋大学食品学院（上海 201306）；3.锦州笔架山食品有限公司（锦州 121000）

随着现代检测技术的蓬勃发展，越来越多的测定方法被应用于食品工业。食品中蛋白质力学稳定性的测定方法有多种，该文主要介绍了热分析技术、单分子技术、流变技术、质构分析。

热分析技术可以测定蛋白质构象变化的热效应，得到蛋白质折叠或解折叠过程中的热力学参数，可以定量测定热诱导产生的蛋白质分子内作用力的变化[1]。研究蛋白质热力学稳定性主要采用差示扫描量热法和等温滴定量热法测得热力学参数，二者最大的区别在于差示扫描量热法的升温程序可以检测蛋白热胶凝化过程热焓的变化，而等温滴定量热法只能在恒温下测定蛋白凝胶的反应热。热力学参数的测定能获得提高食品热稳定性的最大限度，为评估食品稳定性和优化产品加工保藏工艺提供判定依据。

单分子技术是基于单分子层面上的操作，原子力显微镜力谱技术和荧光共振能量转移技术均能用于表征蛋白质分子内的构象变化[2]。

流变技术分析了蛋白质的黏弹特性，在热剪切的作用下，表征剪切速率与黏度的关系[3]。常见的流变学技术方法包括了流变仪分析法和微流变分析仪法。两者有所不同，流变技术是对蛋白溶液进行热剪切得到应力-应变关系，而微流变技术用布朗热运动和粒子运动面积表征应力和应变。

质构分析测定了蛋白凝胶强度，反映的是与蛋白质力学特性有关的食品质地特性。

该文综述了食品中蛋白质力学稳定性的测定方法，以期为评估食品质量提供参数依据，为优化食品产品设计提供技术参考。

1 热分析技术

1.1 差示扫描量热法

差示扫描量热法（differential scanning calorimetry，DSC）是一种高灵敏度的非扰动技术，用于研究热诱导相变的热力学性质，并得到蛋白质折叠或解折叠过程中的热力学参数，包括起始温度（Tonset）、熔融转变温度（Tm）、量热焓（ΔHcal）、复性指数（RI）[4]。Tonset是热诱导蛋白质解折叠的起始温度，Tm是转变最大值，ΔHcal是DSC曲线中的面积，Tm和Tonset值越高蛋白质稳定性越好[5]。DSC测量了溶液温度升高所需的能量，从而提供有关热诱导蛋白质解折叠过程中结构变化的信息[6]。

蛋白质的DSC峰表明不同的蛋白质结构域在不同的温度下展开，用差示扫描量热仪测定猪肉肌原纤维蛋白-明胶混合物热变性温度，猪肉肌原纤维蛋白在57.22 ℃和68.64 ℃出现两个明显的吸热峰，分别为肌球蛋白和肌动蛋白的热变性温度，明胶的加入使肌球蛋白的变性温度降低[7]。近期研究中，研究了冷等离子体（CAP）对阿拉斯加鳕鱼肌原纤维蛋白变性温度的影响，使用差示扫描量热仪测定肌原纤维蛋白的变性温度，高压下经CAP处理后肌原纤维蛋白的变性温度显著升高，热稳定性提高，而低压会破坏肌原纤维蛋白的稳定性，导致分子间作用力减弱和肌原纤维蛋白聚集[8]。

1.2 等温滴定量热法

等温滴定量热法（isothermal titration calorimetry，ITC）是直接检测两种溶液相互作用过程的热效应，获得分子相互作用过程中的结合常数（Kd）、结合计量比（N）、焓变（ΔH）、熵变（ΔS）等热力学参数的一种实验方法[9]，其中Kd和N乘积越小，相互作用越弱，需要加大反应物浓度[10]。根据热力学参数计算出吉布斯自由能ΔG=ΔH-TΔS（ΔH＞0反应吸热，ΔH＜0反应放热），T是绝对温度[11]。

1999年，Michael等[12]提出了ITC可用于定量测量蛋白质间相互作用的热力学性质，通过确定配体与其结合伴侣缔合时产生的热量直接测量结合平衡。随后，基于等温滴定量热法进行热力学分析，有学者研究了有序单体蛋白质与内在无序蛋白质（IDP）在折叠中的相互作用，ITC测量的等温线显示了室温附近的焓从吸热转变为放热，表明了单体蛋白质与IDP结合产生了疏水效应[13]。采用ITC测得T=298 K，pH 7.4条件下比辛和乳清蛋白之间的结合能，将比辛滴定到乳清中得到吸附等温线，ΔH的值为负，而ΔS的值为正，表明熵和焓有助于结合过程，由ΔG=ΔH-TΔS得出ΔG＜0，表明比辛与乳清蛋白的结合具有自发性，疏水作用起主要作用[14]。

2 单分子技术

2.1 原子力显微镜力谱技术

原子力显微镜力谱技术（atomic force microscope single molecule force，AFM-SMF）可以对单个蛋白质分子进行拉伸和松弛，还可以对具有代表性的单蛋白进行机械展开，直接表征蛋白单体特定的折叠和复性[15]。

1986年，原子力显微镜（AFM）被发明，并开始应用于在原子尺度上观察非均匀生物样品的形态和结构[16]。近年来，在传统的AFM基础上结合了单分子力谱技术（SMF），通过持续测量蛋白质中高能构象提供了有关蛋白质折叠途径、动力学特性、相互作用和错误折叠的丰富信息[17]。迄今为止，AFM-SMF在理解糖、DNA和蛋白质的力学性质和力诱导结构重排方面取得了许多突破[18]。

根据力谱测量的定量特性确定打开蛋白质结构域和破坏单个受体或配体键所需力的值，从而在单分子层面得到蛋白质力学性质和结构的关系[19]。原子力显微镜用于蛋白质聚集的单分子表征，在蛋白质聚集初期，溶液中主要存在蛋白单体和寡聚体，AFM成像能够显示蛋白质聚集过程中存在的最小单体和寡聚体，并在纳米尺度上测量其形貌[20]。原子力显微镜还可以用来研究用单个肽分子在底物上的去折叠过程，对单个肽分子进行拉伸，得到不连续的张力曲线，造成不连续性的原因是α-螺旋中部分氢键断裂[21]。

2.2 单分子荧光共振能量转移技术

单分子荧光共振能量转移技术（single molecule fluorescence resonance energy transfer，SM-FRET）用于研究DNA、蛋白质等生物大分子的构象变化[22]。此技术是将单个蛋白分子上荧光供体和受体作为标记位点，定量测量供体和受体之间荧光光强及二者间的共振能量转移效率，得到荧光光强随时间变化的轨迹，再拟合出标记位点之间的距离，经统计学分析得到动力学数据[23]。

每种技术都有其自身的局限性，smFRET也不例外，smFRET的时间分辨极限大约是1 ms，因此，使用该技术探测蛋白质构象时，需要在毫秒级的时间分辨率上进行动力学测量[24]。1996年，单分子荧光共振能量转移技术被发现，并用于研究两个单分子间的相互作用[25]。1999年，首次使用smFRET测得单一蛋白能量传递效率（E＞0.9）[26]。目前smFRET已经被应用于许多不同蛋白质系统中蛋白质分子内构象变化的研究，例如，利用smFRET实现在脂质环境下对蛇形蛋白Ykt6的亚毫秒构象动力学测量，Ykt6与十二烷基磷酸胆碱（DPC）结合，形成稳定的复合物，Ykt6在其蛋白结构域与陷阱核的界面处发生了构象变化，说明脂质环境下蛋白质-脂质的相互作用[27]。

3 流变技术

3.1 流变仪分析法

流变测量分为动态测量和静态测量，蛋白质的黏弹性采用动态测量测定储能模量（G’）、损耗模量（G’’）和黏度（η），而静态测量测定食品中蛋白质的蠕变和应力松弛，主要应用于食品加工领域[28]。

对添加天然淀粉和改性淀粉的肌原纤维蛋白（MP）进行温度扫描动态流变试验，淀粉-肌原纤维蛋白复合物溶胶在热胶凝化过程中的弹性取决于G’，添加淀粉后MP凝胶的G’显著增加，G’与淀粉的糊化温度呈反比[29]。以肌原纤维蛋白（MP）和橄榄油为原料，在NaCl溶液中用MP或非肉蛋白预乳化，在pH 6.2下制备热诱导复合凝胶，用流变仪研究不同的非肉蛋白（大豆分离蛋白、蛋清分离蛋白和酪蛋白酸钠）预乳化液对MP凝胶流变性能的影响，结果为所有乳液组均显著提高了MP凝胶的G’，表明非肉蛋白作为乳化剂修饰MP凝胶的潜力和粉碎肉制品的组织特性[30]。

3.2 微流变分析仪法

与传统流变学方法相比，微流变学方法的优点是不存在干扰表面效应[31]。微流变分析仪基于扩散波光谱学（DWS）技术测量颗粒位移进而分析流体的黏弹特性，通过监测蛋白质分子的均方位移（MSD）实现在无干扰、无破坏的情况下对蛋白质凝胶的测量，从而从微观结构的角度对蛋白质凝胶的黏弹特性进行定量分析[32]。这项技术使用多散斑扩散光谱（MSDWS）检测出散斑图像，并绘制去相关时间tdec-MSD曲线，去相关时间（tdec）是测量时间，并用广义斯托克斯-爱因斯坦扩散关系计算存储模量（G’）和损耗模量（G’’）[33]。

使用示踪粒子和动态光散射技术来监测嵌入蛋白质溶液中的示踪粒子的布朗运动，可以获得样品的零剪切黏度[34]。将粒子示踪微流变学与宏观流变学方法相结合，研究大豆分离蛋白（SPI）溶液及其稳定的乳液酸化过程流变性质的变化，SPI溶液经历了溶液（G’’＞G’）-凝胶（G’＞G’’）-解凝（G’’＞G’）的过程，MSD先增大后减小，结果说明了SPI溶液在酸化过程中，蛋白质产生聚集，后期未完全解聚[35]。

4 质构分析

质构分析（texture Profile Analysis，TPA）模拟测定食品物料单次或多次咀嚼过程中的感官参数，测试结果反映的是食品质构特性，包括硬度、脆性、黏性、内聚性、弹性、胶黏性、咀嚼性、回复性等[36]。

蛋白凝胶质构特性与肉制品的感官特性、理化性质和加工特性密切相关。硬度和弹性是衡量质构特性的两个重要的力学指标，直接影响肉制品的质量。经超细粉碎处理，鸡胸肉肌纤维蛋白胶凝硬度显著增加，弹性提高，具有更好的凝胶性能[37]。质构分析可以设计具有特定质地特性的食品结构，以便寻求更多的替代性蛋白质来源。在酪蛋白调整乳清蛋白凝胶结构特性的研究中，酪蛋白的加入改善了乳清蛋白凝胶结构，使其黏聚性增强，硬度和断裂度降低，保水性得以保持[38]。质构分析还可以评估加工过程中蛋白质的氧化损伤。使用质构仪测定即食鸡肉饼在烹调、冷藏、微波加热过程中的硬度，结论是烤制后的鸡肉饼先冷冻再加热硬度显著下降，表明了肉类蛋白质的氧化损伤在很大程度上影响了经过严格加工的肉类产品的蛋白质质量、营养价值和质地特性[39]。

5 结语与展望

在食品领域中，蛋白质力学稳定性的测定有助于探究其物理性质，并通过定性测量和定量分析得到可靠的数据依据。蛋白质力学稳定性的测定方法可以有效地判定外界环境变化对蛋白质分子内作用力的影响，以及施加外力时蛋白质分子间的作用力变化。但这些测定蛋白质力学稳定性的技术存在着局限性，同一个技术指标采用不同研究手段会存在差异，需要多种技术的联用得到更全面、更准确的力学指标。