牛乳中嗜冷菌产耐热酶的研究进展

2021-04-17邓应旺韩雪涂远强王宇

食品工业 2021年6期

邓应旺，韩雪，涂远强，王宇

哈尔滨工业大学化工与化学学院黑龙江（哈尔滨 150001）

牛乳中含有丰富的蛋白质、矿物质等物质，营养价值极高，被营养学家誉为“白色血液”而备受青睐[1]。牛乳的pH接近中性并且水分含量高，故牛乳也是一种优良的微生物培养基质，极其适于微生物的生长繁殖[2]。虽然鲜牛乳通常被认定为是无菌的，但是挤奶和贮藏运输等过程易被微生物污染。随着冷链运输技术的普遍采用，牛乳中的嗜温微生物生长停滞，而嗜冷菌选择性地生长成为牛乳中的优势菌。

嗜冷菌是一类在0～5 ℃可以生长，最适生长温度一般不超过15 ℃，但最高生长温度可以高于20 ℃的微生物[3-4]。嗜冷菌种类繁多，从新鲜牛乳中最常分离到的是不动杆菌属（Acinetobacter）、无色杆菌属（Achromobacter）、气单胞菌属（Aeromonas）、产碱杆菌属（Alcaligenes）、肠杆菌属（Enterobacter）、黄杆菌属（Flavobacterium）、假单胞菌属（Pseudo-monas）和沙雷菌属（Serratia），其中假单胞菌属是最主要的菌属[5]。嗜冷菌是低温贮藏牛乳中最活跃的一类微生物，与嗜温微生物相比，其细胞膜组成成分有所不同，其中含有大量的多不饱和脂肪酸，熔点降低，使细胞膜在低温下能有良好的流动性[6]；此外，嗜冷菌中还含有抗冻蛋白和冷休克蛋白[7]，这些能帮助嗜冷菌更好的在低温下生长，并且嗜冷菌中参与代谢的酶所需活化能较低，催化效率高[8]，这都给它适应低温创造良好条件。

液态牛乳主要分为两类，一类是巴氏杀菌乳，另一类是UHT乳。这两类乳均采用热处理的方式进行灭菌。虽然热处理能有效杀灭嗜冷菌，但是嗜冷菌在低温环境下分泌的酶高度耐热，经过高温热处理仍然残留活性且在牛乳贮藏期间通过分解蛋白质和脂肪导致牛乳发生沉淀、凝胶和变味，造成发酵产品品质缺陷，进而影响产品货架期[9]。近年来，随着膜分离技术的成熟，由于它具备运行温度低、不易相变、可避免由热加工带来的乳营养损失等优点，是一种安全的冷杀菌技术而受到越来越多乳制品加工企业的青睐。北京三元极致ESL乳就是利用微滤杀菌的乳制品。虽然膜分离通过截留微生物保证乳品的安全性，但是由于嗜冷菌所产耐热酶分子质量较小，不能被有效截留而残留到乳中，造成乳制品保藏过程中变质。因此无论是热杀菌还是冷杀菌，对牛乳中的嗜冷菌及其产生的耐热酶进行研究并找出切实可行的控制方法十分重要。

1 嗜冷菌的分布及多样性

地球上有80%左右的表面处于15 ℃以下，深海地区、高寒地区、永久冻土地区及极地地区占据地球的绝大部分[10]，这些低温地区都为嗜冷菌提供基本的生长繁殖环境。嗜冷菌分布广泛，有研究相继从海洋[11]、北极[12]、南极洲[13]、龙虾肌肉[14]中分离到嗜冷菌，在牛乳中分离到的嗜冷菌主要是假单胞菌属[15]。

身体状况良好的奶牛分泌的牛乳一般被认为是无菌的，因此牛乳中的嗜冷菌主要来自于外部环境，它们的种类和数量也因贮运温度、地域因素、季节因素和贮藏时间变化而变化。Izidoro等[16]研究发现，随着贮存温度升高，嗜冷菌数量也随之增加，因此严格控制低温贮运能有效减少嗜冷菌数量。Hantsis-Zacharov等[17]研究来自以色列北部4个不同农场的原料乳经冷藏后可培养嗜冷菌的多样性，结果发现样品中主要的嗜冷菌为相同菌属，但每种样品的菌群结构并不相同。Kable等[18]比较春、夏和秋三季采集的牛乳的菌群结构，结果发现春季样品中微生物的多样性指数最高，并且认为降雨可能是导致该现象出现的原因。但是，冬季的牛乳中嗜冷菌在微生物菌群中所占比例最高，春秋季节稍低，夏季最低[19]。有研究发现，原料乳在4 ℃条件下贮存时间的延长会导致Pseudomonasspp.和一些Bacillusspp.数量的增加[20]。直接从乳房分泌出来的牛乳中主要是革兰氏阳性的嗜中温需氧菌，只有10%是嗜冷菌，冷藏1 d后，嗜冷菌的含量可增加到微生物总量的50%；冷藏2 d后，嗜冷菌可达到微生物含量的90%以上[5]。由此可见，牛乳从分泌到加工这段时间越短越好，能有效减少嗜冷菌数量增加。

2 嗜冷菌产生的蛋白酶和脂肪酶及其危害机制

嗜冷菌菌体本身对牛乳的危害有限，经过热处理，嗜冷菌基本不能存活，但是其在低温条件下分泌的酶具有高度耐热性，经过巴氏杀菌甚至经过UHT处理依然能保持一定活性，在牛乳的后续贮藏中分解蛋白质、脂肪等物质，影响牛乳风味，破坏牛乳质地，造成腐败变质。

2.1 蛋白酶对牛乳的影响

牛乳中的蛋白酶包括：乳自身的纤维蛋白溶酶和由嗜冷菌产生的耐热蛋白酶，其中纤维蛋白溶酶在生乳中主要以无活性的酶原形式存在，经过热处理几乎完全失活；而嗜冷菌产生的蛋白酶经过UHT处理仍残留一部分的活性。嗜冷菌产生的蛋白酶有胞内、胞壁和胞外蛋白酶，当菌体被杀死后，胞内和胞壁蛋白酶释放到乳中影响产品的品质。研究主要集中于嗜冷菌产的胞外蛋白酶上，尤其是假单胞菌属所产的胞外蛋白酶。

2.1.1 胞外蛋白酶的热稳定性

嗜冷菌分泌的胞外蛋白酶多为碱性金属蛋白酶，Zn2+和Ca2+构成其酶活中心，相对分子质量多为40～50 kDa，一般出现在对数生长末期，最适生长温度30～40℃、pH 6～8，大多数嗜冷菌产生的胞外蛋白酶具有良好耐热性，在140 ℃下的D值为2～300 s[21]。纯化后的蛋白酶在乳中比在水中有更高的稳定性，乳脂肪的存在会增加蛋白酶的耐热性[22]，且乳脂对蛋白水解有促进作用。Dong等[15]研究发现，对于乳脂对蛋白水解活性的影响，有这样几种可能的解释：脂肪会影响假单胞菌的代谢，刺激酶的产生；脂肪会影响蛋白酶释放的形态，蛋白酶更多地暴露活性位点，使其更容易水解蛋白质；水乳状液似的脂肪可以协助蛋白水解酶与其底物之间的疏水相互作用，可能增加活性位点和肽键之间的可达性，促进蛋白酶活性。此外，Chunyue等[23]发现AprX的热稳定性主要归功于其灵活的三级结构，当温度再次降低时，它可以通过钙盐桥的形成快速准确地重新折叠。钙存在时，蛋白酶AprX的耐热性也随之提高。

研究发现，蛋白酶在乳中具有较强的复原活性，经过高温热处理，未彻底失活的蛋白酶在温度降低后再次复原成能分解蛋白质的结构，这一特性决定一旦牛乳中原始蛋白酶数量过多，单一的热处理方式将不能有效抑制蛋白酶[24]。此外，虽然胞外蛋白酶有良好的耐热性，但多数嗜冷菌蛋白酶也具有低温失活现象，即蛋白酶在40～70 ℃热处理较为敏感，这可能是由酶分子间的自我水解引起的[25]。

2.1.2 胞外蛋白酶对牛乳的危害

蛋白酶是一类水解酶，它催化蛋白质水解成氨基酸。嗜冷菌在低温时大量分泌蛋白酶，经过巴氏杀菌和UHT处理，嗜冷菌被灭活但蛋白酶耐高温能持续影响牛乳的质量。在UHT乳中，陈化胶凝是最常见的质量缺陷问题，以贮存过程中牛乳的流动性损失为特征，牛乳的黏度在较长时间内保持恒定，有时甚至稍有降低；之后黏度陡然提高（成熟稠化），并且不久便形成不能再分散的凝胶。凝胶有多种不同类型，从弱而透明的胶凝状态到似凝乳酶凝乳的胶凝状态。

陈化胶凝是一个纯粹的物理-化学凝聚过程，即使产品己形成像凝乳酶凝块似的凝胶，它仍可能是无菌状态。对陈化胶凝化的机理有两种解释，有学者认为在牛乳贮存期间发生的陈化胶凝现象是由乳中残留的蛋白酶活性造成的：乳蛋白被蛋白酶水解，通过形成肽来促进老化凝胶化[26]。乳中的蛋白酶来源有2种：一是嗜冷菌产生的蛋白酶；二是乳中内源性蛋白酶即纤溶酶系，这种酶也能在UHT处理中活下来[27]。也有学者认为牛乳胶凝化老化是一种非酶或物理化学变化，在此过程中没有观察到蛋白质的降解，但这一过程速度较慢，通常需要超过12个月的时间[28]。基于此，Zhang等[29]研究蛋白酶AprX和血纤维蛋白溶酶对牛乳的影响，为减少非酶物理化学变化的干扰，通过在较短的时间内加入高浓度的酶来进行相关研究，得出蛋白酶AprX和血纤维蛋白溶酶都能导致牛乳陈化胶凝化，但机制有所不同，AprX主要是通过水解κ-酪蛋白形成副κ-酪蛋白，使κ-酪蛋白无法发挥稳定蛋白质的性能，导致蛋白质集中，最后蛋白质在重力作用和Ca2+作用下逐渐沉到底部，这个过程中乳清不断排出，出现凝胶。而血纤维蛋白溶酶则是通过水解β-酪蛋白和α-酪蛋白，导致γ-酪蛋白含量升高形成软凝胶破坏牛乳质量。

UHT乳在货架期内还会出现涩味、苦味等风味的变化。UHT乳中残留的耐热蛋白酶水解乳蛋白形成氨基酸和短肽所致，这些短肽和氨基酸残基（苏氨酸等）自身带有苦味，影响产品口味。蛋白水解的发展所导致的牛奶产生苦味，这是陈化凝胶现象可能发生的一个重要特征。

2.2 脂肪酶对牛乳的影响

乳脂肪被分泌于乳脂肪球的一个单一结构，乳脂肪球由一个包含96%～97%的三酰基甘油的核组成，被磷脂和蛋白质层包裹。为了受到脂解酶的作用，三酰基甘油必须通过脂肪球薄膜的分解释放到水相。三酰基甘油被脂肪酶水解产生自由脂肪酸，以此产生不良风味如酸臭味、辛辣味、苦味、涩味等，使牛乳及其衍生物不可食用[30]。

牛乳的水解酸败主要是由于其中的脂肪酶水解乳脂肪造成的。牛乳中的脂肪酶主要有两种来源，一种是牛乳自身含有的脂蛋白酯酶，另一种是牛乳中污染的微生物产生的脂肪酶。脂蛋白酯酶在乳中含量很低、不耐高温，75 ℃、5 min或65 ℃、20 min的热处理或254 nm下紫外线照射30 min可使其失活[31]。脂蛋白脂酶的热稳定性较差，经过热处理基本被灭活，因此主要是对杀菌前的牛乳有影响。牛乳中微生物产生的脂肪酶主要来源于嗜冷菌所产的脂肪酶，这类脂肪酶高度耐热，即使经过UHT处理仍能残留20%～30%的活性[32]。残留的脂肪酶在后续牛乳的贮藏中持续进行破坏，分解脂肪成脂肪酸，导致牛乳酸败。

脂肪酶是甘油三酯酰基水解酶，是一种丝氨酸水解酶。脂肪酶除水解三酰基甘油外，还能够催化酯化反应、酯交换、酸解、醇解及氨解等。一些嗜冷菌分泌的脂肪酶经过高温处理能够保持大部分活力，有的脂肪酶在150 ℃时的D值（酶活性减少90%所需的时间）达到290 s[33]。与牛乳中的脂蛋白脂肪酶相比，嗜冷菌产生的脂肪酶能够对包裹在脂肪球外的脂肪球膜进行破坏，使其失去对脂肪的保护作用，严重破坏原料乳和乳制品中的脂肪[34]。由于脂肪球膜被破坏，脂肪球失去稳定性，粘在一起，严重时表现出脂肪上浮。同时，脂肪被分解释放出的游离脂肪粘合，互相碰撞的脂肪球形成脂肪球簇，也会导致乳中脂肪上浮[35]。Zhang等[36]研究发现将UHT乳进行加热和均质，均质作用使天然乳脂肪球机械破碎成更小的颗粒，之后天然乳脂肪球膜不足以覆盖较大的脂肪球表面积。因此，脂肪球的表面被吸附的牛奶蛋白所覆盖和稳定，主要是酪蛋白，可将其称为脂肪表面吸附蛋白（FSAP）。而耐热性的蛋白酶能够水解α-酪蛋白和β-酪蛋白，破坏乳脂肪球和酪蛋白表面结构，引起脂肪与脂肪、脂肪与酪蛋白结合并聚集，形成小的薄片浮于乳的上部[37]。

UHT乳中残留的耐热脂肪酶对乳脂肪的水解产生脂肪氧化味，特别是水解产生的一些游离脂肪酸具有不良风味。因此，控制UHT乳中残留脂肪酶和蛋白酶的含量可有效抑制UHT乳贮存期间的脂肪和蛋白水解，从而有效防止UHT乳贮存期间风味的改变。

3 嗜冷菌及其耐热酶的控制

牛乳中的嗜冷菌及其耐热酶短期内无法找到合适的方法去彻底消灭，但可以采取一些方法来适当控制嗜冷菌的生长以降低损失。1）控制原料乳中的嗜冷菌数量。中国现行国标GB 19301—2010规定生乳的微生物含量≤2×106CFU/mL。有研究发现，原料乳中一定数量的嗜冷菌（106CFU/mL）不适宜长期UHT乳（保质期9个月），但在制作奶酪时对奶酪令人满意的风味和芳香有益[38]。在卫生条件良好的情况下，在取自健康奶牛的新鲜生奶中，嗜冷菌的数量少于102CFU/mL，但是原料乳从分泌到加工通常需要一定时间，这段时间有利于嗜冷菌生长[39]。Dong等[40]研究发现，原料乳在7 ℃冷藏时嗜冷菌数量每天以10 CFU/mL增长，经过UHT处理之后，原料乳中原始细菌数量越多，蛋白水解程度越快。因此，应尽量缩短原料乳从分泌到加工这段时间以减少嗜冷菌的原始数量。2）深度冷藏。相同的原料乳在2 ℃储存比在4 ℃储存生产出的UHT乳保质期更长，可采用深度冷藏的方法减少嗜冷菌及其代谢产物的产生[41]。3）低温钝化。将原料乳或UHT牛乳在55 ℃下热处理60 min通常能够使产品中的蛋白水解酶活性显著降低。然而，将低温钝化应用于实际生产中会有很多麻烦，其中最重要的是来源于不同微生物的蛋白酶表现出不同的钝化温度，从50～60 ℃不等，由于这些温度特异性非常强，所以除非了解每一批牛奶所污的染酶的特性，否则所选择的低温钝化的条件将是无效的。4）利用加压CO2。刘美凤等[42]研究加压CO2对荧光假单胞菌的杀菌效果，证明加压CO2可以有效杀灭荧光假单胞菌并抑制蛋白酶的分泌。5）高压均质。Oliveira等[43]研究发现，高压均质能降低荧光假单胞菌蛋白酶造成的乳蛋白水解。对于含3%脂肪的牛乳，在100 MPa高压均质处理下，蛋白水解程度降低29%，胶凝化出现的时间至少延迟23 d；在150 MPa高压均质处理下，蛋白水解程度降低51%，胶凝化出现的时间至少延迟40 d。虽然高压均质能减缓蛋白水解的速度，但不能钝化嗜冷菌产生的蛋白酶，也不能降低脱脂乳中的蛋白水解程度。

目前最有效的方法依旧是控制原料乳中的原始嗜冷菌数量，缩短原料乳从分泌到加工的时间，有效减少微生物数量，相应地耐热酶含量也降低，这能有效保证乳及乳制品的质量。