p21活化激酶2基因变异体rs3662C>A与卒中风险和预后的关系及其对转录活性的影响

司 斌，张舒媛，杨云云，陈 宇，张伟丽*

(1.首都医科大学脑重大疾病研究中心 北京脑重大疾病研究院，北京100050;2．中国医学科学院 北京协和医学院 国家心血管病中心 阜外医院 心血管疾病国家重点实验室，北京 100037)

卒中(stroke)的发病率、致死率和致残率高，是危害中国人民健康的“头号杀手”[1]。卒中病因复杂，受环境因素和遗传因素的共同影响[2-3]，在相似传统危险因素特征的人群中，卒中的发生风险存在个体差异。血管重塑和血管壁结构异常是卒中的重要发病机制[4]。血管内皮细胞功能异常可诱发动脉粥样硬化，导致缺血性卒中，血管重塑功能缺陷可诱发微血管瘤，导致出血性卒中。研究表明，p21活化激酶2a(p21-activated kinase 2，PAK2)是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，在血管结构中表达，影响血管内皮细胞的迁移和血管通透性，调控脑血管发育[5-6]；抑制PAK2基因表达时，可导致斑马鱼发生脑出血表型[7]。然而，PAK2基因与人类卒中的关系，仍属未知。

本研究以初发卒中患者为研究对象，利用全国多中心、大规模的病例-对照队列和前瞻性随访研究，分析PAK2基因变异体(variants)与卒中患病易感性和预后的关系，并通过功能学实验探究遗传变异影响PAK2基因表达的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂及细胞：人胚胎肾细胞系HEK293T(中国医学科学院基础医学研究所细胞中心，中国北京)；pMIR-Report荧光素酶报告载体(Thermo Fish Scientific公司)； Lipofectamine®3000(Invitrogen公司)；双荧光素酶报告分析系统(Promega公司)；血液基因组DNA非柱式提取试剂盒(北京康为世纪公司)；microRNA mimics(吉玛基因公司)；引物合成(北京六合华大基因)。

1.1.2 研究对象：卒中病例的入组时间为2000年12月至2001年12月，来自全国7家临床中心(北京、西安、重庆、山东和天津各1个，武汉2个)[8]。研究获得中国医学科学院阜外医院伦理委员会的批准(2006CB503800)，所有患者均签署知情同意书。本研究包括1 649例初发卒中患者，年龄30～74岁，汉族，彼此无血缘关系。入选患者均经严格的神经系统检查、计算机断层扫描(computed tomography, CT)或磁共振成像(magnetic resonance imaging, MRI)确诊。排除标准：1)有脑血管疾病史；2)其他类型的卒中：蛛网膜下腔出血、脑动脉瘤型脑出血、短暂性缺血性卒中发作；3)既往有风湿性心脏病和房颤的患者；4)有恶性肿瘤或严重慢性疾病的患者。

本研究包括1 727例对照，来源于社区健康居民，无心脑血管疾病史，按照性别、年龄(不超过±5岁)、居住地区与卒中患者进行匹配。

医生采用门诊、电话的方法对卒中患者进行随访，每2年1次，至2006年5月结束，平均随访4.5年。随访终点事件主要包括心脑血管事件(卒中再发和心肌梗死)、心脑血管疾病死亡和全因死亡。临床终点事件委员会根据患者的医疗记录确认疾病诊断，通过死亡证明或者询问家庭成员、同事获得患者死亡信息。

1.2 方法

1.2.1 研究对象的分组及处理：卒中患者分为3类亚型：动脉粥样硬化性脑梗死(cerebral thrombotic stroke)患者733例、腔隙性脑梗死(lacunar infarc-tion)患者488例、脑出血(intracerebral hemorrhage)患者435例。记录患者的基线资料，包括年龄、性别、身高、体质量、血糖、血脂、吸烟、饮酒、糖尿病史、卒中家族史、高血压史等。

1.2.2 提取外周血基因组DNA：禁食12 h后采取外周静脉血。用全血基因组DNA提取试剂盒提取外周血白细胞基因组DNA，样本于-20 ℃冰箱保存。

1.2.3PAK2基因遗传变异的选择和基因型的检测：PAK2基因位于染色体3q29。本研究使用生物信息学软件TargetScan(http://www.targetscan.org)对PAK2基因3′非翻译区(3′untranslated region, 3′UTR)进行序列分析，发现rs3662(C>A)位于microRNA-511(miR-511)与PAK2结合区域，可能影响该基因的转录调控和表达。利用Sequenom MassARRY SNP技术[9](飞行时间质谱法)检测rs3662的基因型。正向引物序列：5′-GTCAACGCGTATC ATGGCTATTGAGATGGT-3′，反向引物序列：5′-CG GCAAGCTTTCTAAAACTGACTTTTTCACA-3′；延伸引物序列：5′-GCCATAACTATCTAGCTTTGAG-3′。

1.2.4 载体构建与荧光素酶活性的检测：将PAK2基因3′UTR序列插入pMIR-Report荧光素酶报告载体，构建pMIR-rs3662C和pMIR-rs3662A质粒。将HEK293T细胞以每孔1.2×104个种于96孔细胞培养板，每孔体积100 μL，于37 ℃、5% CO2培养箱中孵育12 h，待细胞汇合度达到80%时，将pMIR-rs3662C和pMIR-rs3662A质粒分别与miR-511共转染入HEK293T细胞。实验分组为：1)阴性对照组pMIR-Report载体，实验组pMIR-rs3662C和pMIR-rs3662A；2)阴性对照组pMIR-rs3662C+miRNA-NC，实验组pMIR-rs3662C+miRNA-511；3)阴性对照组pMIR-rs3662A+miRNA-NC，实验组pMIR-rs3662A+miRNA-511。

使用双荧光素酶报告分析系统在Infinite M200 Pro多功能酶标仪上检测萤火虫荧光素酶活性和海肾荧光素酶活性。以海肾荧光素酶活性作为内参，计算相对荧光素酶活性(relative luciferase activity，RLU)，RLU=(重组质粒荧光素酶活性-空白对照载体荧光素酶活性)/(海肾荧光素酶活性-空白对照载体荧光素酶活性)。实验重复3次。

1.3 统计学分析

采用χ2检验分析rs3662的基因型频率分布是否符合Hardy-Weinberg平衡。利用多元Logistic回归模型分析rs3662与卒中风险的相关性，并校正传统危险因素(包括年龄、性别、体重指数、吸烟、饮酒、血糖、血脂、糖尿病史、卒中家族史、高血压史)。用比值比(odds ratio,OR)和95%可信区间(confidence interval,CI)表示相对危险度。利用多元Cox生存回归模型分析rs3662与心脑血管事件风险、卒中后心血管死亡风险、全因死亡风险的相关性，并校正上述传统危险因素。用风险比(hazards ratio,HR)和95%CI表示相对危险度。使用SPSS Statistics 20.0(SPSS Inc，Chicago，USA)进行数据分析。

2 结果

2.1 研究对象的临床特征

本研究包括1 649例卒中患者和1 727例健康对照人群。与对照组比较，卒中患者常常同时伴有高血压、糖尿病、冠心病以及卒中家族史，具有高水平的血糖、总胆固醇和三酰甘油以及低水平的高密度脂蛋白胆固醇，并常伴有不健康的生活方式(如吸烟、饮酒)(表1)。

2.2 PAK2基因遗传变异rs3662C>A与卒中患病风险的关系

rs3662C>A的基因型频率在卒中病例组和对照组人群中的分布均符合Hardy-Weinberg平衡。rs3662A等位基因与降低动脉粥样硬化性脑梗死的患病风险相关，加性遗传模型OR为0.72(95%CI:0.53～0.99，P<0.05)，显性遗传模型OR为 0.67(95%CI:0.47～0.95，P<0.05)(表2)。rs3662与卒中风险的关系有性别差异。rs3662 A等位基因主要与降低男性动脉粥样硬化性脑梗死的患病风险显著相关, 加性遗传模型OR为0.54(95%CI:0.34～0.85，P<0.01)，显性遗传模型OR为 0.50(95%CI:0.31～0.83，P<0.01)(表3)。

表1 卒中患者和对照组的临床资料特征比较Table 1 Clinical characteristics of stroke cases and control

表2 PAK2基因变异体rs3662与卒中患病风险的相关性Table 2 Association between variant rs3662 at PAK2 gene and risk of stroke

表3 PAK2基因变异rs3662与卒中患病风险的性别差异Table 3 Sex-specific difference for association between variant rs3662 at PAK2 gene and risk of stroke

2.3 PAK2基因遗传变异rs3662C>A与卒中患者预后的关系

卒中患者的平均随访时间为4.5年(范围为0.1～6.0年)，随访过程中82例(5.0%)因居住地变迁而失访，随访率95%。共有371例患者发生心脑血管事件，290例死亡，其中161例为心血管病死亡。在动脉粥样硬化性脑梗死患者中，携带rs3662A等位基因的患者发生心脑血管事件的风险显著升高(HR：1.84，95%CI：1.16～2.92;P<0.05)，以及心血管死亡风险显著升高(HR：2.06，95%CI：1.05～4.04;P<0.05)(表4)。

2.4 PAK2基因遗传变异rs3662C>A对PAK2转录活性的影响

对PAK2基因3′UTR序列进行生物信息学预测分析，发现rs3662C位于miR-511与PAK2 基因结合的种子序列内，C等位基因变为A等位基因时，miR-511与PAK2基因的结合能力消失(图1)。

将报告基因质粒pMIR-rs3662C(野生型)和pMIR-rs3662A(突变型)分别与miR-511共转染入HEK293T细胞，检测荧光素酶活性。pMIR-rs3662C促进miR-511与PAK2基因3′UTR结合，显著降低荧光素酶的表达活性达79%(P<0.01)；而pMIR-rs3662A为功能缺失型变异，对荧光素酶的表达活性无显著影响；在未转染miR-511时，pMIR-rs3662C和pMIR-rs3662A的荧光素酶表达活性差异无统计学意义(图2)。

3 讨论

PAK2是小G蛋白Rho家族中三磷酸鸟苷(guanosine triphosphate，GTP)的效应物，参与细胞增殖和凋亡功能[10-11]。PAK2基因在脑血管高表达，在血管发育和成熟过程中发挥重要作用，维护血管的稳定性、通透性和完整性[5-6]。PAK2突变可诱发斑马鱼脑出血[7]。此外，动脉粥样硬化斑块内的新生血管丰富，这些微血管易破损、易渗漏，可促进斑块的不稳定进展，导致缺血性卒中[12-13]。本研究通过全国多中心卒中病例-对照研究，首次发现PAK2基因遗传变异rs3662A的携带者患动脉粥样硬化性脑梗死的风险低于rs3662CC基因型携带者，但发生心脑血管事件和心血管死亡的风险升高。分子机制研究显示rs3662影响PAK2基因的表达活性。

HEK293T细胞是人源肾上皮细胞系，培养繁殖速度快、转染效率高，是研究外源性重组质粒功能的常用工具细胞系，可高效稳定的表达外源性融合蛋白[14]。本研究利用pMIR-Report荧光素酶报告基因实验，体外转染HEK293T细胞，检测荧光素酶活性，发现PAK2表达受到rs3662C>A调节。rs3662C位于miR-511与PAK2 基因3′-UTR结合的种子序列，可通过miR-511促进PAK2降解，显著降低该基因的表达活性。rs3662C变为rs3662A时，miR-511与PAK2不结合，可维持PAK2表达，有助于血管稳定。该分子机制可在一定程度上解释rs3662A携带者患动脉粥样硬化性脑梗死的风险低于rs3662CC基因型携带者。然而，rs3662与卒中风险的性别差异，尚需要进一步阐明性激素的作用机制。

表4 PAK2基因变异rs3662与卒中患者心血管事件和死亡风险之间的关系Table 4 Association between variant rs3662 at PAK2 gene and risk of CVD events and mortality in stroke cases

The variant rs3662 is an C to A change and indicated by red color fonts in the seed binding region图1 遗传变异rs3662位于miR-511与PAK2基因3′UTR序列的结合区域Fig 1 Variant rs3662 occurs in the binding site for miR-511 in the 3′-UTR of PAK2 gene

本研究结果显示PAK2与卒中预后相关，这反映了PAK2基因在心血管功能中的复杂作用。研究发现，PAK2调节血管生成因子的形成，通过激活MAPK/ERK信号通路，促进血管内皮细胞增殖、迁移、细胞间黏连以及血管生成，影响新生血管的完整性[15]，这不利于卒中后缺血梗死区域的侧枝循环形成和恢复。目前，需要更多的流行病学证据和生物学研究来阐明PAK2在心脑血管疾病及其死亡中的作用。

本研究存在以下局限性：第一，rs3662C>A与卒中风险及其预后之间的关系有待于在其他独立的人群队列中进行验证；第二，尚未完全阐明rs3662C>A影响PAK2基因表达的分子机制及其在心脑血管病理生理过程中发挥的作用。

综上所述，PAK2基因遗传变异rs3662C>A与动脉粥样硬化性脑梗死的患病风险以及预后风险相关，本研究将有助于识别具有卒中高风险的个体并进行心脑血管疾病的预警。