基于分子对接及网络药理学初探马齿苋抗骨质疏松症“多成分-多靶点”的分子机制

买买提明·努尔买买提，吉米丽汗·司马依，古丽娜孜·肉孜，海力里·麦麦提，穆妮热·排尔哈提，优丽吐孜·阿克拉木，阿衣努尔·买提斯迪克*

(1.新疆医科大学维吾尔医学院，乌鲁木齐 830011；2.新疆医科大学药学院，乌鲁木齐 830011；3.新疆维吾尔自治区维吾尔医医院，乌鲁木齐 830049)

骨质疏松症(OP)是一种以骨量减少、骨组织显微结构退化、可导致骨脆性和骨折危险性增加为特征的全身性代谢性疾病。最新调查研究发现，全球OP患者约有2亿人，我国40～49、50～65、65岁以上人群OP患病率分别为3.2%、19.2%、32.0%，OP及其相关的骨折患者达9 000万，占常见病发病率排名的第7位。每年对OP的治疗费用约为250亿元，不仅给患者带来痛苦，也对患者家庭和社会带来严重的经济负担。因此，OP的预防和治疗是一项急需解决的问题[1-2]。目前，常用的OP疗法仅限于改善临床症状，其疗效进展缓慢，价格昂贵，且药物靶向性单一，上述一系列问题急需寻找新思路来解决。研究报道[3-4]，系统性炎症和氧化应激也是OP的发病机制之一，提供了通过抗炎、抗氧化来治疗OP的新思路。现代中药药理学研究发现[5]，中药防治OP具有独特的优势和广阔的发展前景。

马齿苋(PortulacaoleraceaL.)分布于世界各地，是我国传统的药食兼用1年生草本植物。中医学认为其具有清热解毒、凉血止血和止痢等功效。研究发现[6-7]，马齿苋营养品质高于许多栽培蔬菜，其富含β胡萝卜素、维生素C和α亚麻酸等，具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗衰老、降血脂、松弛骨骼肌、止疼和创口愈合等作用。马齿苋成分极为复杂，抗OP的机制研究较少。本研究通过网络药理学研究方法，科学地筛选马齿苋的活性成分，系统地揭示马齿苋通过“多成分-多靶点”治疗OP的作用机制，阐述其“多成分-多靶点-多通路”协同作用，为马齿苋的基础研究及临床应用提供科学依据，见图1。

图1 基于网络药理学的马齿苋抗OP的药理学机制示意图Fig.1 A schematic diagram of the network pharmacology based strategis for determining the pharmacological mechanisms of the Portulaca oleracea L.on OP

1 材料与方法

1.1分析平台、数据库和软件 中药系统药理学数据库(TCMSP)(https://tcmspw.com/tcmsp.php)；中药综合数据库(TCMID)(http://www.megabionet.org/tcmid/)；中药分子机制的生物信息学分析工具(BATMAN-TCM)(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)[8-10]；蛋白数据库(Uniprto)(https://www.uniprot.org)；富集分析数据库(DAVID，V6.8)(https://david.ncifcrf.gov/)；毒性与基因比较数据库(CTD)(http://ctdbase.org/)；综合药物信息数据库(DrugBank)(https://go.drugbank.com/)；疾病相关的基因与突变位点数据库(DiSGeNET)(https://www.disgenet.org/search)；治疗靶点数据库(TTD)(http://db.idrblab.net/ttd/)；蛋白结构数据库(PDB)(http://www.rcsb.org/)；蛋白相互作用网络数据库(String)(http://genemania.org/)；网络可视化软件(Cytoscape，V3.7.1)(https://cytoscape.org)；三维分子结构软件(PyMol)(https://pymol.org/)；分子对接软件(AutoDock Tools，V1.5.6)(http://autodock.scripps.edu)；国家生物技术信息中心(NCBI，PubChem)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)；化学成分数据库(Chemical Book)(https://www.chemicalbook.com/ProductIndex.aspx)。

1.2成分的收集与活性成分的筛选 通过TCMSP、TCMID和BATMAN-TCM数据库和分析平台收集马齿苋活性成分，根据ADME参数的口服生物利用度(OB)和类药性(DL)指标进行筛选。DL是对于某种化合物判断其是否具有良好的临床疗效相关联的物理化学性质及生物学特性的指标，DL越大，则成药性越高。OB是衡量药物进入人体循环系统有效性的重要指标。良好的OB是化合物具有药理活性的基本前提。Lipinski指出，ADME参数综合了药代动力学性质与药物的安全性。本研究按照OB≥30%、DL≥0.18条件进行筛选[13-16]。

1.3活性成分作用靶点的预测及筛选 首先，通过TCMSP数据库收集活性成分对应的靶点。其次，将所有靶点通过Uniprot数据库以“Homo sapiens”(人属)为关键词进行基因-蛋白名称转化。

1.4OP 特异性靶点的检索及药物-疾病共有靶点的分析 首先，利用 “Osteoporosis”作为关键词，检索及筛选CTD、TTD、DiSGeNET和DrugBank等数据库，获得OP的已知靶点。其次，通过String数据库置信度得分设计阈值(Score值)[17](Score越大，各蛋白之间相互作用表达就越强，Score≥0.9表示最高的置信度)，将蛋白-蛋白相互作用进行分析、筛选并得到OP的特定靶点。最后，对潜在靶点对应的成分进行筛选得到潜在的成分。

1.5分子对接 首先，通过PubChem和Chemical Book数据库将成分结构进行确证，未找到的化合物用ChemDraw软件绘制化合物三维结构。其次，蛋白通过PDB数据库检索构象并筛选。筛选标准为：(1)通过X晶体衍射法获取蛋白结构；(2)蛋白的晶体解析度小于3Å；(3)明确的蛋白序列和明确的蛋白；(4)自带小分子配体的蛋白。再次，成分与蛋白进行分子对接。步骤：使用AutoTools加氢去除水分子，对蛋白进行预处理；其次使用AutoGrid进行能量格点计算，有小分子配体的蛋白其活性位点定义在原配体所在的位置，无小分子配体的蛋白，其活性位点由POCASA计算得到；最后使用AutoDock Vina进行小分子与蛋白对接，取优势构象进行分析，并用Schrodinger可视化。

1.6通路分析与网络构建 活性成分和作用靶点通过Cytoscape V3.7.1软件构建“草药-活性成分-作用靶点”(HB-cC-cT)。String数据库得到的OP特定靶点构建蛋白-蛋白相互作用网络图。潜在成分和潜在靶点构建“草药-潜在成分-潜在靶点”(HB-pC-pT)网络图。用潜在靶点(pT)及其参与的生物学过程(BP)构建了“靶点-生物学”(pT-BP)网络图。基因本体(GO)生物过程和京都基因与基因组百科全书(KEGG)将潜在靶点通过DAVID数据库进行GO基因功能和KEGG通路分析。

2 结果

2.1活性成分的筛选结果 TCMSP、TCMID和BATMAN-TCM数据库收集的成分分别为54、17、9个。通过TCMSP分析平台按照ADME的OB和DL参数筛选得到10个成分和394个靶点，见表1。

表1 马齿苋活性成分的ADME筛选Tab.1 Candidate compounds from Portulaca oleracea L.screened by ADME

2.2活性成分作用靶点的预测与筛选结果 靶点通过Uniprot数据库进行基因名称-蛋白名称转换，整理后得到208个作用靶点。

2.3HB-cC-cT网络图的构建及分析结果 见图2。由图2可知，该网络由219个节点(1个草药、10个活性成分和208个作用靶点)和379个边缘组成。四角形(cC)和圆形(cT)之间的边缘表示相互作用。四角形表示10个活性成分，其中C1表示5，7-dihydroxy-2-(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)chroman-4-one，圆形表示208个作用靶点。图形的大小按照网络拓扑参数自由度(Degree)的大小来决定，Degree与其生物功能呈正比，Degree越大表明其参与的生物功能越多，生物学重要性越强[18]。其中半胱氨酸蛋白酶-3(CASP3)、磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶催化亚单位γ亚型(PIK3CK)、前列腺素G/H合酶2(PTGS2)、前列腺素G/H合酶1(PTGS1)、雄激素受体(AR)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARG)和孕酮受体(PGR)等靶点的Degree较大，表示参与的生物功能越多，其生物学重要性越强。

图2 “草药-活性成分-作用靶点”网络图Fig.2 HB-cC-cT network

2.4OP特异性靶点的筛选结果 本研究通过CTD、TTD、DrugBank、DiSGeNET等国际公认的疾病靶点数据库检索与OP发生、发展密切相关的靶点，结果分别为78、7、13、440个，删除重复靶点，共检索到455个靶点。将靶点导入String数据库筛选得到195个OP特异性靶点，将208个OP特异性靶点与其进行映射，得到32个“药物-疾病”共有的潜在靶点，见图3。

图3 “OP-相关蛋白”相互作用网络图Fig.3 "OP-related protein"interaction network

2.5HB-pC-pT 网络的构建及分析结果 见图4。由图4可知，马齿苋的8个潜在成分作用于32个OP特异性靶点，其中CASP3、转录因子AP-1 (JUN)、α-丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT1)、血红素加氧酶1(HMOX1)、PTGS2、半胱氨酸蛋白酶-9(CASP9)、凋亡调节因子Bcl-2(BCL2)、半胱氨酸蛋白酶-8(CASP8)、丝裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、肿瘤坏死因子(TNF)、AR、血管内皮生长因子A (VEGFA)、DNA拓扑异构酶Ⅱ(TOP2A)、细胞色素氧化酶1B1(CYP1B1)、72 kDaⅣ型胶原酶(MMP2)和凋亡调节剂(BAX)等靶点可能是马齿苋发挥治疗OP作用的关键靶点。

图4 草药-潜在成分-潜在靶点网络图Fig.4 HB-pC-pT network

2.6GO基因功能和KEGG通路分析结果 见图5。由图5可知，19个生物过程主要集中在细胞凋亡，包括凋亡过程、凋亡过程的负调控、凋亡过程的正调控、凋亡过程的调控、细胞凋亡的执行期以及内源性凋亡信号途径等。除此之外，还有炎症反应、对雌二醇的反应和维生素D代谢过程等生物学过程，与文献相吻合[3-4]。由此表明，马齿苋潜在靶点的生物学过程均与OP密切相关。

图5 马齿苋治疗OP的“靶点-生物学”过程图Fig.5 pT-BP of Portulaca oleracea L.for treating OP

将32个潜在靶点导入DAVID数据库分析KEGG信号通路，按照错误发现率(FDR)进一步筛选通路，FDR在富集分析中越小，代表富集显著程度越高。按照FDR≤0.01，共收集了11条主要信号通路，破骨细胞分化、Toll样受体信号通路、甲状腺激素信号通路、TGF-β信号通路、细胞因子-细胞因子-受体相互作用、MAPK信号通路、HIF-1信号通路、TNF信号通路、NOD样受体信号通路、PI3K-Akt信号通路和JAK-STAT信号通路，见表2。破骨细胞分化的FDR最小，表示富集显著程度最高，与文献相吻合[4]。由此表明，马齿苋不仅可抑制因NO减少而形成的炎症，还可通过多种通路发挥抗OP作用。

表2 OP特异性靶点的11个显著的KEGG信号通路Tab.2 Top 11 significantly enriched KEGG pathways in OP specific proteins

2.7分子对接分析结果 通过分子对接进一步验证了活性成分与其潜在靶点之间的结合方式。研究发现，32个潜在靶点中，8个OP特异性靶点与来自马齿苋的6个活性成分相互作用，其他24个靶点缺乏合适的蛋白质晶体结构而未被讨论。对接得分(Score)表示配体与受体结合的匹配度，Score越大，结合活性和稳定性越好。Score≤-4.25认为配体与靶点具有一定的结合活性；Score≤-5.00认为配体与靶点的结合活性较好；Score≤-7.00认为配体与靶点结合活性更强烈、更稳定[19]。6个活性成分与8个潜在靶点对接结果表明，其中AR、血清白蛋白(ALB)、细胞色素P4501B1(CYP1B1)、PGR和PPARG 5个靶点与6个活性成分具有较好的结合活性，见图6和表3。

表3 马齿苋活性成分与潜在靶点的分子对接得分 (Score≤-5.0)Tab.3 Docking scores between active compounds and potential targets of Portulaca oleracea L.(Score≤-5.0)

图6 马齿苋活性成分与潜在靶点的分子对接图Fig.6 Molecular docking map of active components and potential targets in Portulaca oleracea L.

由图6可知，图6A是山柰酚结合在AR蛋白的活性位点，有较好的匹配，其酚羟基与THR887氨基酸形成氢键相互作用，小分子与TRP741、PHE764、MET745之间形成3个π-π相互作用。图6B是山柰酚结合在ALB蛋白的活性位点，有较好的匹配，其酚羟基分别与LEU154氨基酸形成氢键相互作用，与TYR138氨基酸的苯环形成1个π-π相互作用。图6C是木犀草素结合在AR蛋白的活性位点，其酚羟基与MET745氨基酸形成氢键相互作用，小分子与PHE765之间形成1个π-π相互作用，这些相互作用是促进小分子结合到活性位点的主要结合力。图6D是槲皮素结合在CYP1B1蛋白的活性位点，小分子与PHE237之间形成1个π-π相互作用。图6E是5，7-dihydroxy-2-(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)chroman-4-one结合在PGR蛋白的活性位点，其酚羟基与GLN778氨基酸形成氢键相互作用，此外小分子与ASN719和PHE778之间形成2个π-π相互作用。图6F是花生四烯酸结合在PPARG蛋白的活性位点，其酚羟基分别与HIS448和TYR314氨基酸形成2个氢键相互作用。结果表明，氢键和π-π相互作用对小分子与蛋白的识别和稳定性起着关键作用。成分-靶点网络分析证实了马齿苋的活性成分通过与相关蛋白相互作用而发挥抗OP的作用，分析结构进一步阐明了活性化合物与蛋白之间精确的分子机制。

3 结论

马齿苋的成分较多、药理作用复杂，对OP的药理作用机制研究报道较少。T Jin等[20]研究报道，马齿苋提取物通过抑制脂多糖诱导的巨噬细胞(RAW247.7)产生NO，从而导致炎症。杨远超等[21]报道，马齿苋乙醇提取物对脂多糖诱导的骨质疏松症小鼠模型骨体积分数、骨小梁数量和骨小梁分离度显著增高。Kim J Y等研究发现[22]，马齿苋可通过抑制Akt/GSK3beta-c-Fos-NFATc1信号转导途径发挥抗破骨细胞活性。李赛玉等[23]研究发现，马齿苋可通过抗氧化缓解去卵巢骨量丢失，改善骨代谢。综上所述，马齿苋有可能成为治疗OP的新天然药物。

网络药理学技术通过预测中药靶点，拟筛选中药有效成分及其作用靶点，科学地解释中药及复方的药理作用。通过从已开放的数据库中收集及筛选治疗OP相关的中药活性成分及其相应的靶点，构建相关调控网络，确定调控的重要信号通路及子网络[23-25]。本文通过现有的数据库、平台和软件描述了马齿苋治疗OP的潜在成分以及活性成分与潜在靶点进行分子对接，结合信号通路描述了多成分-多靶点-多通路之间的直接联系，特别是基因调控、信号传导通路和细胞因子等方面的机制研究，为后期的实验提供科学依据。

“草药-活性成分-作用靶点”网络中，PTGS1和PTGS2基因都可将花生四烯酸转化为前列腺素H2，PTGS1参与前列腺素类的产生，而高浓度的前列腺素对分离的破骨细胞有抑制作用[26]。核受体在生物体内分布广泛，包括配体依赖性核受体(ER、AR)和孤儿核受体(ERRα、PPARG)，其中AR属于配体依赖的类固醇激素核受体超家族成员[28-29]，AR活性对维持雄性小鼠松质骨发育和骨形成起到重要作用[30]。分子对接结果也表明，山柰酚(Score=-10.7)和木犀草素(Score=-10.7)结合在AR蛋白的活性位点，氢键和π-π相互作用对小分子与蛋白的识别和稳定性起着关键作用。PPARG或PPARγ的高表达促使骨髓基质干细胞向脂肪细胞分化，抑制成骨细胞分化而减少成骨细胞生成，在成骨细胞的成熟中起着积极作用[31]，其激动剂可通过MAPK信号通路促进成骨细胞凋亡[32]，抑制PPARG表达，增加成骨细胞数量，提高雄性小鼠骨质量[31]；花生四烯酸(Score=-6.8)结合在PPARG蛋白的活性位点，氢键的作用对小分子与蛋白的识别和稳定性起着关键作用。研究报道，PPARG的配体通过改变骨髓微环境中细胞因子的水平，而对破骨细胞的分化及功能产生影响[33]。对马齿苋而言，槲皮素具有雌激素样作用，通过ER和ERK途径提高成骨细胞碱性磷酸酶的活性[34]。木犀草素能促进成骨细胞分化和矿化过程[35]。文献报道，山柰酚能通过刺激雌激素受体增强其活性来促进成骨细胞激活及增殖、分化和矿化的能力[36]，PPARG的配体可对破骨细胞的分化及功能产生影响。本研究表明，马齿苋的槲皮素、山柰酚、木犀草素、花生四烯酸、5，7-dihydroxy-2-(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)chroman-4-one和β-谷甾醇等潜在成分能结合在PPARG蛋白的活性位点，但这些成分能否抑制PPARG、增加成骨细胞数量，尚未有研究报道，需要进一步研究。目前，除马齿苋上述的成分和靶点及其机制外，其余潜在靶点相关研究尚未见报道，这为今后进一步研究马齿苋的作用机制以及新的适应症提供了线索。

KEGG通路分析结果表明，马齿苋通过直接和间接地调节骨代谢信号通路来抗OP。骨吸收和骨形成失衡是OP发生的最重要的发病机制，骨吸收和骨形成是受到相关的骨代谢信号通路的影响，如破骨细胞分化(FDR最小)、TGF-β和MAPK信号通路等。MAPK信号通路参与调控骨细胞的增殖及分化，维持骨代谢[37]；TGF-β信号通路参与骨形成，可促进骨原细胞向软骨细胞、成骨细胞分化，抑制破骨细胞的活性[38-39]。此外，在显著富集的信号通路中也存在部分调控其他系统的信号通路，如Toll样受体信号通路和NOD样受体信号通路等。研究报道，PI3K可通过激活 Akt，增加Ras同源基因家族A的表达量，从而改变细胞骨架[37]。

本研究结果具备一定的可信度和参考价值，对于相关基础及临床实验的设计、开展能够起到指导作用。