一测多评法测定固本统血颗粒中7种成分的含量

张荣华，王桂红，殷 杰

(1.武汉市黄陂区中医医院药剂科，武汉 430300；2.湖北中医药大学药学院，武汉 430065)

紫斑是因血络受损，血溢于肌肤，以皮肤出现青紫斑点或斑块、抚之不碍手为特征的出血性疾病，多因热毒窜络、血热妄行、脾虚气不摄血、外伤等，使血不循经、外溢肌肤而致[1]。根据临床症状分为血热型、阴虚型、气虚型和瘀阻型。固本统血颗粒现收载于《中国药典》2015年版一部[2]，由巴戟天、淫羊藿、枸杞、黄芪、党参和肉桂等10味中药材按照中医药“君臣佐使”配伍理论组方制成，主治畏寒肢冷、腰酸乏力、尿清便溏、皮下紫斑其色淡黯等因阳气虚损、血失固摄所致紫斑或轻型原发性血小板减少性紫癜。

中成药复方制剂是多成分的集合体，具有多靶点、整体性、协同作用等特点，原有的单一成分质量评价模式已经不能适应现代中药的发展，一测多评法(QAMS)利用中成药复方制剂中各成分间存在的内在函数关系，建立内参物与各成分间的相对校正因子(RCFs)，通过测定其中质量稳定、价廉易得的成分而达到多指标成分的同时测定，有效规避了传统多指标成分质量控制检验成本过高、部分对照品不稳定、价高不易得等不足。QAMS法既可应用于同类型成分的同时测定，也可用于不同类型成分的测定[3-4]。固本统血颗粒现行质量标准仅对淫羊藿苷进行了定量控制，暂未检索到对该制剂进行定量研究的报道。本实验根据中成药复方制剂中医配伍理论，结合中药质量标志物确认原则[5]，选取质量稳定、价廉易得的主要药效成分淫羊藿苷为内参物，采用QAMS法对固本统血颗粒中水晶兰苷、去乙酰基车叶草苷酸、车叶草苷酸、朝藿定A、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ和东莨菪苷含量进行同时测定，建立了固本统血颗粒多指标成分的质量评价模式，为全面评价固本统血颗粒的整体质量奠定实验基础。

1 仪器与试药

1.1仪器 Agilent 1100型高效液相色谱仪和Agilent Zorbax SB-C18液相色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，均购自美国Agilent公司；UltiMate 3000型高效液相色谱仪(美国赛默飞世尔科技有限公司)；ME204E型电子分析天平(德国梅特勒-托利多公司)；Phenomenex C18液相色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，美国Phenomenex公司)；Waters Symmetry C18液相色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，美国Waters公司)；KQ-400KDE型超声波清洗器(上海精密仪器仪表有限公司)。

1.2试药 水晶兰苷(批号111870-201303，质量分数为95.3%)、淫羊藿苷(批号110737-201516，质量分数为94.2%)和宝藿苷Ⅰ对照品(批号111852-201603，质量分数为99.9%)，均购自中国食品药品检定研究院。去乙酰基车叶草苷酸(批号PRF8032242，质量分数为98.8%)、车叶草苷酸(批号PRF8050928，质量分数为98.2%)、朝藿定A(批号15042107，质量分数为97.1%)和东莨菪苷对照品(批号PRF8042028，质量分数为99.4%)，均购自成都普瑞法科技开发有限公司；乙腈为色谱纯，其余试剂为分析纯；固本统血颗粒(规格：20 g·袋-1，批号分别为：20190601、20190819、20191010)，株洲千金药业股份有限公司。

2 方法与结果

2.1色谱条件 Agilent Zorbax SB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱温：30 ℃。乙腈(A)-2 mL·L-1磷酸(B)为流动相，梯度洗脱(0～14.0 min，18.0%A；14.0～26.0 min，18.0%A～23.0%A；26.0～39.0 min，23.0%A～58.0%A；39.0～47.0 min，58.0%A～75.0%A；47.0～55.0 min，75.0%A～18.0%A)。流速：1.0 mL·min-1；检测波长：235 nm(0～26.0 min检测水晶兰苷、去乙酰基车叶草苷酸和车叶草苷酸)[6-9]，270 nm(26.0～39.0 min检测朝藿定A、淫羊藿苷和宝藿苷Ⅰ)[10-20]，346 nm(39.0～55.0 min检测东莨菪苷)[21-23]；进样量：10 μL；理论塔板数按照各成分色谱峰计算均不小于3 500。

2.2溶液的制备

2.2.1混合对照品储备液 精密称取7种成分对照品各适量，用体积分数为50%的乙醇制成质量浓度分别为1.498、0.674、0.156、0.618、1.794、0.932、0.118 mg·mL-1的混合对照品储备液。

2.2.2混合对照品溶液 精密量取2.2.1项下制备的混合对照品储备液2.5 mL，用体积分数为50%的乙醇稀释至50 mL，制得7种成分质量浓度分别为74.9、33.7、7.8、30.9、89.7、46.6、5.9 μg·mL-1的混合对照品溶液。

2.2.3供试品溶液 取固本统血颗粒适量，将内容物研细，精密称取3.0 g，加入体积分数为50%的乙醇25 mL，称定质量，超声(功率：400 W，频率：40 kHz)提取30 min，放冷后用体积分数为50%的乙醇补足减失的质量，即得。

2.2.4阴性样品溶液 按照固本统血颗粒的处方工艺分别制备缺巴戟天、淫羊藿和枸杞的阴性样品，再按照2.2.3项下方法分别制成阴性样品溶液。

2.3方法学考察

2.3.1专属性实验 取2.2项下制备的混合对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液，按照2.1项下色谱条件进样分析，色谱图见图1。由图1可知，供试品溶液色谱图中7种成分色谱峰峰形对称，分离度均大于1.5；阴性样品对固本统血颗粒中7种成分的定量测定无干扰，表明该方法专属性良好。

图1 HPLC图A.混合对照品溶液；B.供试品溶液；C.巴戟天阴性样品溶液；D.淫羊藿阴性样品溶液；E.枸杞阴性样品溶液；1.水晶兰苷；2.去乙酰基车叶草苷酸；3.车叶草苷酸；4.朝藿定A；5.淫羊藿苷；6.宝藿苷Ⅰ；7.东莨菪苷。Fig.1 HPLC chromatogramsA.mixed reference substance solution；B.sample solution；C.Morindae officinalis Radix negative sample solution；D.Epimedii folium negative sample solution；E.Lycii fructus negative sample solution；1.monotropein；2.deacetylasperulosidic acid；3.asperulosidic acid；4.epimedin A；5.icariin；6.baohuosideⅠ；7.scopolin.

2.3.2线性关系考察 精密量取2.2.1项下制备的混合对照品储备液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，分别用体积分数为50%的乙醇稀释至20 mL，制成系列混合对照品溶液1～6，检测7种成分的峰面积，以质量浓度为横坐标(x)、峰面积为纵坐标(y)进行线性回归，见表1。

表1 7种成分的线性关系和范围Tab.1 Linearity and ranges of 7 components

2.3.3精密度实验 取2.2.2项下制备的混合对照品溶液，重复进样6次，测得7种成分峰面积的RSD值分别为0.63%、0.88%、1.12%、1.09%、0.57%、0.71%、1.16%，表明仪器精密度良好。

2.3.4重复性实验 取同一批固本统血颗粒，按照2.2.3项下方法平行制备6份供试品溶液，进样检测7种成分色谱峰的峰面积，计算得各成分含量的RSD值分别为1.04%、1.17%、1.35%、1.29%、0.96%、1.10%、1.41%，表明实验重复性良好。

2.3.5稳定性实验 取2.2.3项下制备的供试品溶液，于0、2、4、8、16、24 h进样检测7种成分色谱峰的峰面积，测得各成分峰面积的RSD值分别为0.59%、0.97%、1.08%、1.15%、0.54%、0.77%、1.21%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.6回收率实验 取7种成分含量已知的固本统血颗粒9份，每份1.5 g，根据《中国药典》2015年版四部要求，分别按照已知含量的50%、100%、150% 3个水平精密加入混合对照品溶液(7种成分质量浓度分别为0.569、0.247、0.059、0.221、0.617、0.341、0.039 mg·mL-1)1.0、2.0、3.0 mL，各3份，再按照2.2.3项下方法制备加样供试品溶液，按照2.1项下色谱条件进样检测，计算7种成分的平均回收率。结果7种成分的平均回收率(RSD值)分别为99.67%(0.72%)、98.73%(1.06%)、96.98%(1.18%)、97.94%(1.25%)、100.14%(0.69%)、99.10%(0.75%)、97.37%(1.47%)。

2.4RCFs的测定及耐用性考察

2.4.1RCFs的测定 以淫羊藿苷为内参物，精密吸取2.3.2项下制备的系列混合对照品溶液1～6，按照2.1项下色谱条件进样检测7种成分的峰面积，按照公式：RCFR/S=fR÷fS=(AS×CR)÷(AR×CS)(式中AS表示内参物峰面积，CS表示内参物质量浓度，AR表示其他成分峰面积，CR表示其他成分质量浓度)，分别计算6种成分的RCFs，结果见表2。

表2 以淫羊藿苷为内参物的6种成分的RCFs Tab.2 RCFs of the other 6 constituents with icariin as an internal standard

2.4.2不同仪器、色谱柱对RCFs的影响 以淫羊藿苷为内参物，精密吸取2.2.2项下制备的混合对照品溶液，按照2.1项下色谱条件进样测定7种成分的峰面积，对比考察UltiMate 3000型、Agilent 1100型高效液相色谱仪及Agilent Zorbax SB-C18、Phenomenex C18、Waters Symmetry C183种型号色谱柱对RCFs的影响，结果见表3。

表3 不同仪器、色谱柱对RCFs的影响Tab.3 Influences of different instruments and columns on RCFs

2.4.3不同柱温对RCFs的影响 以淫羊藿苷为内参物，精密吸取2.2.2项下制备的混合对照品溶液，按照2.1项下色谱条件进样测定7种成分的峰面积，对比考察不同柱温(28、29、30、31、32 ℃)对RCFs的影响，结果见表4。

表4 不同柱温对RCFs的影响Tab.4 Influences of different column temperatures on RCFs

2.4.4不同流速对RCFs的影响 以淫羊藿苷为内参物，精密吸取2.2.2项下制备的混合对照品溶液，按照2.1项下色谱条件进样测定7种成分的峰面积，对比考察不同流速(0.8、0.9、1.0、1.1、1.2 mL·min-1)对RCFs的影响，结果见表5。

表5 不同流速对RCFs的影响Tab.5 Influences of different flow rates on RCFs

2.5待测化合物色谱峰的定位 以淫羊藿苷为内参物，精密吸取2.2.2项下制备的混合对照品溶液，按照2.1项下色谱条件进样测定，记录7种成分色谱峰的保留时间，采用相对保留时间值(RRT)法对待测化合物色谱峰进行定位，结果见表6。

表6 不同仪器、色谱柱对RRT的影响Tab.6 Influences of different instruments and columns on RRT

2.6QAMS法与外标法(ESM)测定结果比较 取3批固本统血颗粒，按照2.2.3项下方法每批平行制备供试品溶液3份，按照2.1项下色谱条件进样测定7种成分的峰面积，分别采用ESM法和QAMS法计算7种成分的含量，结果见表7。

表7 固本统血颗粒中7种成分的含量测定结果 (n=3)Tab.7 The content determination results of 7 components in Guben Tongxue Granules (n=3)

3 讨论

3.1目标化合物的选择 固本统血颗粒由巴戟天、淫羊藿、枸杞、黄芪、党参和肉桂等10味中药制成，方中淫羊藿温补肾阳，黄芪补气升阳、生津养血，合为君药；巴戟天、锁阳补肾阳、益精血，菟丝子补益肝肾，党参健脾益肺、养血生津，山药补脾养胃、补肾生津，共为臣药；枸杞滋补肝肾，为佐药；附子善入气分而散寒止痛，肉桂善入血分而温经通脉，温肾助阳、温经散寒止痛，同时肉桂引药于足少阴肾经，为使药，诸药共奏，以达温补脾肾、益气止血之功。朝藿定A、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ等黄酮类化合物为君药淫羊藿的主要有效成分；水晶兰苷、去乙酰基车叶草苷酸、车叶草苷酸等环烯醚萜类成分为臣药巴戟天的活性成分；东莨菪苷为佐药枸杞的香豆素类代表性成分。本实验参考中药质量标志物确认原则，选取上述7种化合物作为定量测定的目标化合物，以期更加全面地评价固本统血颗粒的质量。

3.2供试品溶液制备方法的选择 考虑到固本统血颗粒处方中10味中药材均经过提取、浓缩后入药，所含成分较易被提取，参考相关文献，首先在超声[6-8，11-15，24]提取60 min的条件下对比考察了不同提取溶剂(体积分数为80%甲醇[6-7]、甲醇[22，25-26]、体积分数为70%的乙醇[8，12-13，18]和体积分数为50%的乙醇[11，14，16])对7种成分综合提取率的影响，结果以体积分数为50%的乙醇作为提取溶剂时，各成分综合提取率最佳；同时为缩短供试品溶液的制备时间，降低杂质成分对检测结果的影响，又分别对不同超声提取时间(15、30、60 min)进行对比考察，最终确定采用体积分数为50%的乙醇超声提取30 min作为固本统血颗粒供试品溶液的制备方法。

本实验采用QAMS法对固本统血颗粒中7种成分的含量进行了同时测定，该方法操作便捷、结果准确、专属性强，较传统多组分质量控制模式降低了检验成本，有利于普及应用，为全面评价固本统血颗粒的质量提供了参考，同时通过对该制剂质量标准的提升，有助于药品生产企业不断完善原药材的内控质量标准以及制剂生产过程的参数控制，确保产品质量和临床疗效的一致性和有效性。