顶空气相色谱法测定甲钴胺原料药的7种溶剂残留

顾晓风，田沛霖

(苏州市药品检验检测研究中心，苏州 215104)

甲钴胺又称甲基维生素B12，是维生素B12在体内的活性形式之一。甲钴胺为抗周围神经病变药，通过促进核酸和蛋白质的合成，恢复神经轴突传递的延迟和神经传递物质的减少，临床主治由糖尿病引起的神经障碍、多发性神经炎，尤其对糖尿病并发症，如麻木、疼痛及麻痹有明显的效果[1-3]。

甲钴胺以氰钴胺为原料，在其生产过程中，经大孔树脂吸附提纯，普遍采用XAD1180大孔树脂[4]，属于苯乙烯骨架型，可能引入正己烷、苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯和二乙烯苯等残留[5-6]，后用丙酮进行重结晶，可能引入丙酮残留。甲钴胺收录于《中国药典》2020年版二部中，但未对其残留溶剂进行规定[7]。甲钴胺的进口药品注册标准JX20040191规定了丙酮的测定方法[8]，所用溶剂α-甲氧基乙醇毒性大，且仅特定品牌对丙酮测定无干扰；直接进样峰形较差，样品中的甲钴胺残留在分流平板上易造成污染。文献报道[9-10]，目前尚未对甲钴胺多种溶剂残留，特别是大孔树脂残留进行系统地研究。按照人用药品注册技术国际协调会(ICH)及《中国药典》的相关要求，采用大孔树脂吸附净化时，需对树脂残留进行检测[11]。为确保原料药的安全、有效和可控，本文采用顶空气相色谱法，拟对甲钴胺原料药中的丙酮、正己烷、苯、甲苯、二甲苯、二乙烯苯和苯乙烯7种溶剂进行检测[12-19]，为甲钴胺及其制剂的质量标准提供参考。

1 仪器与试药

1.1仪器 7890B/7697A型顶空气相色谱仪，Agilent DB-WAX(30 m×0.32 mm，0.5 μm)石英毛细管柱，安捷伦科技(中国)有限公司；XS205DU型电子天平，瑞士梅特勒-托利多公司。

1.2试药N，N-二甲基甲酰胺(色谱纯，德国默克公司)；丙酮、正己烷、苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯和二乙烯苯均为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)；水为去离子水(密理博公司)；7批甲钴胺原料药，分别由卫材(中国)药业有限公司(批号分别为181252、181253、190451、190551、200453)和河北华荣制药有限公司(批号分别为190118-02、191219-05)生产。

2 方法与结果

2.1色谱条件 采用Agilent DB-WAX(30 m×0.32 mm，0.5 μm)石英毛细管柱。程序升温，起始温度为40 ℃，保持5 min，以10 ℃·min-1的速率升至180 ℃，保持5 min。进样口温度为220 ℃，分流比为2∶1。检测器为氢火焰离子化检测器(FID)，温度为250 ℃。载气为高纯氮，流速为1.5 mL·min-1。顶空平衡温度为80 ℃，平衡时间为30 min，定量环温度为95 ℃，传输管温度为110 ℃，进样时间为1 min。

2.2溶液的制备

2.2.1混合对照品储备液 精密称取苯、正己烷、甲苯、二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯和丙酮适量，加质量浓度为100 g·L-1的N，N-二甲基甲酰胺溶解并稀释成质量浓度分别为4.06、40.16、40.72、39.92、10.79、10.02、1 022.46 μg·mL-1的混合溶液。精密移取上述混合溶液10 mL，加水稀释至100 mL，摇匀，即得。

2.2.2混合对照品溶液 精密吸取2.2.1项下制备的混合对照品储备液10 mL，置于100 mL量瓶中，加质量浓度为100 g·L-1的N，N-二甲基甲酰胺溶液稀释至刻度，摇匀，移取5 mL置于顶空瓶中，加盖密封，即得。

2.2.3供试品溶液 精密称取甲钴胺0.1 g，置于顶空瓶中，精密加入质量浓度为100 g·L-1的N，N-二甲基甲酰胺溶液5 mL，加盖密封，超声(500 W，40 kHz)处理1 min使溶解，即得。

2.2.4空白溶液 精密移取质量浓度为100 g·L-1的N，N-二甲基甲酰胺溶液5 mL，置于顶空瓶中，加盖密封，即得。

2.3专属性考察 取2.2项下制备的空白溶液、混合对照品溶液和供试品溶液，按照2.1项下色谱条件进行测定，色谱图见图 1。由图1可知，空白溶液无干扰，混合对照品溶液中，各峰的理论塔板数均大于5 000，拖尾因子均小于1.5，分离度大于2.0，符合分析要求。其中二甲苯出峰峰号5、6、7、8，二乙烯苯出峰峰号10、11、12、13，定量以各峰面积之和计算[20]。

图1 GC图A.空白溶液；B.混合对照品溶液；C.供试品溶液；1.正己烷；2.丙酮；3.苯；4.甲苯；5、6、7、8.二甲苯；9.苯乙烯；10、11、12、13.二乙烯苯。Fig.1 GC chromatogramsA.blank solvent；B.mixed reference substance solution；C.sample solution；1.hexane；2.acetone；3.benzene；4.toluene；5，6，7，8.xylene；9.cinamene；10，11，12，13.divinyl benzene.

2.4精密度考察 取2.2.2项下制备的混合对照品溶液6份，按照2.1项下色谱条件进行测定。结果7种溶剂峰面积的RSD值分别为2.68%、0.30%、2.01%、1.82%、1.79%、1.50%、1.62%，表明仪器精密度良好。

2.5线性关系考察 精密移取2.2.1项下制备的混合对照品储备液20、10、5、2、1 mL，分别置于100 mL量瓶中，加质量浓度为100 g·L-1的N，N-二甲基甲酰胺溶液稀释至刻度，摇匀。精密移取上述系列溶液各5 mL，置于顶空瓶中，密封。按照2.1项下色谱条件进行测定，以质量浓度为横坐标(x)、峰面积为纵坐标(y)绘制标准曲线，见表1。

2.6定量限和检测限 取2.2.1项下制备的混合对照品储备液，逐级稀释，测定并记录峰面积，当信噪比为10∶1时，得到定量限(LOQ)；信噪比为3∶1时，得到检测限(LOD)。结果见表1。

表1 回归方程、线性范围、LOD与LOQTab.1 Regression equations，linear ranges and LOD and LOQ

2.7回收率实验 精密移取2.2.1项下制备的混合对照品储备液7.5、5.0、2.5 mL，分别置于100 mL量瓶中，加质量浓度为100 g·L-1的N，N-二甲基甲酰胺溶液稀释至刻度，摇匀。精密称取甲钴胺(批号190451)9份，每份0.1 g，分别置于顶空瓶中，每3份为1组。3组分别精密加入上述3种溶液各5 mL，加盖密封，超声(500 W，40 kHz)处理1 min使溶解，按照2.1项下色谱条件进行检测，计算平均回收率，结果见表2。

表2 回收率实验结果 (n=9)Tab.2 Results of recovery tests (n=9)

2.8样品含量测定 取7批样品，按照2.2.3项下方法制备供试品溶液后进行测定，以外标法计算样品中残留溶剂的含量，结果见表 3。

表3 样品含量测定结果Tab.3 Determination results of sample content

3 讨论

3.1溶剂的选择 甲钴胺在水中微溶，而正己烷、苯和苯乙烯等有机溶剂在水中几乎不溶，添加N，N-二甲基甲酰胺能提高这些溶剂在水中的溶解度。N，N-二甲基甲酰胺质量浓度过低时，有机溶剂可能析出，影响准确度；N，N-二甲基甲酰胺质量浓度过高时，会影响蒸气压，造成顶空进样，影响灵敏度。经考察，选用质量浓度为100 g·L-1的N，N-二甲基甲酰胺溶液作为溶剂，结果重复性好，大部分有机溶剂响应值高，灵敏度满足要求。

3.2色谱柱的选择 比较了中等极性毛细管柱Agilent DB-1701(30 m×0.32 mm，0.5 μm)和极性毛细管柱Agilent DB-WAX(30 m×0.32 mm，0.5 μm)，结果表明，极性毛细管柱Agilent DB-WAX(30 m×0.32 mm，0.5 μm)更好地实现二甲苯与二乙烯苯多个峰之间的完全分离。

3.3顶空条件的选择 考察顶空平衡温度，温度设置为70、80、90 ℃。结果表明，当温度为70 ℃时，高沸点物质峰面积小，灵敏度较差；当温度为80 ℃时各峰的峰面积重复性好，峰响应较好；温度80、90 ℃之间无显著差异，故选择80 ℃作为顶空平衡温度。

分别考察了顶空平衡时间为15、30 min，结果表明，平衡时间为30 min时，各峰峰面积更加稳定，故选择30 min作为顶空平衡时间。

4 小结

参考《中国药典》2020年版、甲钴胺进口注册标准JX20040191及ICH有关规定，本文控制7种溶剂的残留限度分别为不得超过0.05%、0.002%、0.000 2%、0.002%、0.002%、0.000 5%、0.000 5%。本文建立了甲钴胺中7种残留溶剂的顶空气相色谱法，对收集到的7批样品进行测定，其中2批样品检测出树脂残留，5批检测出丙酮残留，结果均在限度范围内。该方法操作简单，灵敏度高，可用于甲钴胺残留溶剂的质量控制。