草香胃康胶囊中7种成分的含量测定及聚类分析

张 凯，马灵珍

(1.辽宁中医药大学附属医院药学管理部，沈阳 110032；2.亳州职业技术学院药学院，亳州 236800)

草香胃康胶囊由木香、阿魏、决明子、鸡内金、海螵蛸和牡蛎6味中药制成，主治胃脘疼痛、饥后尤甚、泛吐酸水、食欲不佳和心烦易怒等肝气犯胃所致胃痛、胃及十二指肠球部溃疡、慢性胃炎等症[1]。草香胃康胶囊现收载于《中国药典》2015年版一部，标准中仅对佐药决明子所含大黄酚进行了定量研究，而大黄酚来源广泛，作为草香胃康胶囊定量测定指标成分专属性不强，同时检索到与该制剂定量检测相关的文献也仅限单一组分检测[2-6]。中药及其制剂具有多靶点、整体协同作用等特点，单一组分检测具有一定的片面性，多指标成分质量控制模式近年来已广泛应用于其质量控制中。本实验根据君臣佐使中医组方理论，选取以下成分为检测指标：君药木香所含指标性成分木香烃内酯和去氢木香内酯，臣药阿魏所含活性成分阿魏酸，佐药决明子所含代表性成分红镰霉素-6-O-β-龙胆二糖苷、决明子苷C、橙黄决明素和美决明子素，采用HPLC法同时测定草香胃康胶囊中7种成分的含量，并采用统计软件对所测含量进行聚类分析，为全面评价草香胃康胶囊的整体质量提供数据支持。

1 仪器与试药

1.1仪器 Shimadzu LC-20A型高效液相色谱仪(日本岛津公司)；ME204E型电子分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；KQ-500E型台式超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2试药 对照品：阿魏酸(质量分数为99.4%，批号110773-201915)，木香烃内酯(质量分数为99.9%，批号111524-201911)，去氢木香内酯(质量分数为99.5%，批号111525-201912)，橙黄决明素(质量分数为98.3%，批号111900-201605)，均购自中国食品药品检定研究院；红镰霉素-6-O-β-龙胆二糖苷(质量分数为98.5%，批号PRFM90308-04)，美决明子素(质量分数为99.6%，批号PRF8101721)，均购自成都普瑞法科技开发有限公司；决明子苷C(质量分数为98.0%，批号CFS201901)，购自武汉天植生物技术有限公司。乙腈，色谱纯，德国Merck公司；其他试剂均为分析纯，均购自上海吉至生化科技有限公司。草香胃康胶囊(规格：0.5 g·粒-1，批号分别为280084、280086、280088、280094、280102、280107、280063、280075、280077、280079，编号分别为S1～S10)，均购于广西玉林制药集团有限责任公司。

2 方法与结果

2.1溶液的制备

2.1.1混合对照品溶液的制备 精密称取阿魏酸、木香烃内酯、去氢木香内酯、红镰霉素-6-O-β-龙胆二糖苷、决明子苷C、橙黄决明素和美决明子素对照品各适量，用甲醇制成质量浓度分别为0.112、0.378、0.406、1.182、0.454、0.338、0.262 mg·mL-1的混合储备液。精密吸取上述储备液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，分别用甲醇稀释至20 mL，制成系列溶液1～6；取系列溶液3作为混合对照品溶液(7种成分质量浓度分别为5.6、18.9、20.3、59.1、22.7、16.9、13.1 μg·mL-1)。

2.1.2供试品溶液的制备 取草香胃康胶囊内容物，研细，精密称取1.0 g，加入25 mL甲醇，称质量，超声处理45 min，放冷后用甲醇补质量，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，即得草香胃康胶囊供试品溶液。取按草香胃康胶囊质量标准项处方比例及制法制备的缺木香、缺阿魏、缺决明子的阴性供试品适量，按上述方法制成阴性供试品溶液。

2.2色谱条件 以乙腈-1 mL·L-1甲酸为流动相，流速：0.8 mL·min-1。梯度洗脱，洗脱程序：0～8 min，12%乙腈；8～19 min，12%～25%乙腈；19～27 min，25%～42%乙腈；27～36 min，42%～65%乙腈；36～40 min，65%～12%乙腈。Kromasil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱温：25 ℃；进样量：10 μL。检测波长：320 nm(0～12 min检测阿魏酸)[5-11]，225 nm(12～19 min检测木香烃内酯和去氢木香内酯)[12-15]，284 nm(19～40 min检测红镰霉素-6-O-β-龙胆二糖苷、决明子苷C、橙黄决明素和美决明子素)[16-19]。精密吸取2.1.1项下混合对照品溶液及2.1.2项下溶液各10μL，进样分析检测，记录色谱图(图1)。结果在供试品色谱图中7种成分色谱峰峰形对称，拖尾因子符合《中国药典》规定，分离度均>1.5；理论板数按7种成分色谱峰计算均≥3 500，阴性样品对草香胃康胶囊中7种成分的测定无干扰。

图1 HPLC图A.混合对照品溶液；B.供试品溶液；C.阿魏阴性样品；D.木香阴性样品；E.决明子阴性样品；1.阿魏酸；2.木香烃内酯；3.去氢木香内酯；4.红镰霉素-6-O-β-龙胆二糖苷；5.决明子苷C；6.橙黄决明素；7.美决明子素。Fig.1 HPLC chromatogramsA.mixed reference substance solution；B.sample solution；C.negative sample without Ferulae Resina；D.negative sample without Aucklandiae Radix；E.negative sample without Cassiae Semen；1.ferulic acid；2.costunolide；3.dehydrocostuslactone；4.rubrofusarin-6-O-β-gentiobioside；5.cassiaside C；6.aurantio-obtusin；7.obtusifolin.

2.3线性关系考察 精密吸取2.1.1项下6个系列溶液各10 μL，进样分析检测草香胃康胶囊中7种成分的峰面积，以各成分的峰面积(y)对质量浓度(x)进行线性回归，得7种成分的回归方程、线性范围及r值。见表1。

表1 7种化合物的线性关系Tab.1 Linear relationships of the 7 constituents

2.4精密度实验 精密吸取2.1.1项下混合对照品溶液10 μL，重复进样检测6次，测得7种成分峰面积的RSD值分别为1.13%、0.99%、0.91%、0.56%、0.67%、0.83%、1.04%。

2.5重复性实验 取草香胃康胶囊6份，按2.1.2项下步骤配制供试品溶液，依法进样分析检测，记录所检测成分的峰面积，计算，得7种成分含量的RSD值分别为1.87%、1.63%、1.76%、0.92%、1.35%、1.69%、1.77%。

2.6稳定性实验 按2.1.2项下步骤临用新配1份草香胃康胶囊供试品溶液，于0、2、4、6、12、18 h进样检测7种成分的峰面积，结果供试品溶液在18 h内稳定，7种成分峰面积的RSD值分别为1.09%、1.01%、0.88%、0.57%、0.71%、0.82%、0.98%。

2.7回收率实验 取7种成分含量均已知的同一批草香胃康胶囊9份，倾出内容物，研细，精密称取0.5 g，3份，分别精密加入混合对照品溶液(根据样品中化合物含量另行配制，7种成分质量浓度分别为0.029、0.104、0.139、0.432、0.161、0.089、0.067 mg·mL-1)1.0、2.0、3.0 mL，再按2.1.2项下步骤制成加样供试品溶液，进样分析检测7种成分的峰面积并计算其含量。7种成分回收率及RSD值见表2。

表2 回收率实验结果 (n=9)Tab.2 Results of recovery tests (n=9)

2.8样品含量测定 取10个批次的草香胃康胶囊，按照2.1.3项下方法制成供试品溶液，各批次平行制备3份，按照2.2项下色谱条件进样检测7种成分的峰面积和含量，结果见表3。

表3 样品含量测定结果Tab.3 Results of the sample content determination

2.9聚类分析 为了考察不同批次草香胃康胶囊中7种成分的含量差异，采用SPSS 26.0软件组间联接聚类方法，以欧氏距离为测度，对10批草香胃康胶囊进行聚类分析，结果见图2。由图2可知，当类间距离为10时，10批样品聚为4类，S1、S3、S2、S4聚为第一类，S5、S6聚为第二类，S9、S10、S8聚为第三类，S7为第四类；当类间距离为15时，10批样品聚为2类，第一类和第二类合并为一类，第三类和第四类合并为另一类。由分类结果可知，目标化合物含量差异与样品相关，可能与草香胃康胶囊生产所用原药材的产地来源、采收时节以及原药材不同批次间的质量差异有关。

图2 10批草香胃康胶囊聚类分析树状图Fig.2 Cluster analysis tree diagram of 10 batches of Caoxiang Weikang Capsules

3 讨论

3.1目标化合物的确定 草香胃康胶囊由阿魏、木香、决明子、鸡内金、海螵蛸和牡蛎6味中药材配伍而成，方中木香行气止痛、健脾消食、调畅气机而解郁，鸡内金健胃、消积食，共为君药；阿魏消积化瘕，可增强君药鸡内金的消食化积之功，为臣药；决明子清热明目、润肠通便，海螵蛸收敛止血、制酸止痛，牡蛎软坚散结、重镇安神，共为佐使药。诸药合奏，以达泄肝和胃、行气止痛的临床功效。木香为菊科植物木香的干燥根，木香烃内酯和去氢木香内酯为其指标性成分；阿魏为伞形科植物新疆阿魏或阜康阿魏的树脂，阿魏酸为其主要活性成分；决明子为豆科植物决明或小决明的干燥成熟种子，红镰霉素-6-O-β-龙胆二糖苷、决明子苷C、橙黄决明素和美决明子素等为其代表性成分。本文参考中药质量标志物确认原则，选取阿魏酸、木香烃内酯、去氢木香内酯、红镰霉素-6-O-β-龙胆二糖苷、决明子苷C、橙黄决明素和美决明子素为定量测定目标成分，为全面评价草香胃康胶囊的整体质量提供参考。

3.2流动相的选择 在进行梯度洗脱时，本实验先后考察了甲醇-水[12-13]、甲醇-3 mL·L-1冰醋酸[5-7]、乙腈-1 mL·L-1磷酸[16，18-21]和乙腈-1 mL·L-1甲酸[17]4个流动相体系。结果显示，以乙腈-1 mL·L-1甲酸为流动相时，基线平稳，7种成分色谱峰对称度良好，且与相邻色谱峰分离效果较好。故采用乙腈-1 mL·L-1甲酸为流动相进行梯度洗脱，同时检测草香胃康胶囊中7种成分的含量。

本实验建立了能同时测定草香胃康胶囊中7种成分含量的HPLC法，该方法结果准确、操作便捷，并对含量测定结果进行了聚类分析，有利于药品生产企业和监管部门不断提升草香胃康胶囊的质量标准，完善制剂生产所用原药材的来源及内控标准，确保药品临床疗效一致性，为全面、科学地评价草香胃康胶囊的整体质量提供参考。