miRNA-206在乳腺癌中的表达及与内分泌耐药相关性研究*

莫军扬，张敏敏，唐 茜，卢林捷，陈 岩，韦业刚，覃舒婷

（广西柳州市人民医院普外三科，柳州 545006）

微小RNA(mi RNAs，miR)是一种内源性非编码RNA，具有抑癌基因或类癌基因的功能，影响恶性肿瘤的发生发展。最近研究发现，miRNA在乳腺癌的诊断、预后、耐药等多方面起了重要作用[1-2]。本研究运用实时荧光定量聚合酶链反应（qPCR）检测乳腺癌患者癌组织中miR-206 的表达，探讨其与患者临床特征、激素受体之间是否存在相关性，以期能成为一种新的预测患者预后及内分泌治疗敏感度的标记物。

1 资料与方法

1.1 研究对象

收集2014年1月～12月于广西柳州市人民医院普外三科住院、治疗完整的100例女性乳腺癌患者的肿瘤组织标本，患者年龄39～61 岁，平均(50.08±10.85)岁；所有患者均按WHO乳腺肿瘤分类标准进行病理学分型，其中TNM 分期分为I 期25例，Ⅱ期56例，Ⅲ期19例；无淋巴结转移48例，有淋巴结转移52例；病理类型：浸润性导管癌95例，中分化腺癌1例，小叶癌2例，导管内癌2例。所有患者在采集组织标本前均未经放、化疗治疗，且无炎症等合并症。

1.2 主要试剂

Hipure FFPE miRNA Kit 提取分离试剂盒购自广州Magen 公司；ReverTra Ace ToYoBo qPCR RT Kit 反转录试剂盒购自上海ToYoBo 公司；PCR 采用KAPA Probe Fast qPCR Master Mix试剂盒购自北京KAPA公司；定量PCR仪购自上海安捷伦公司，型号Mx3005P。

兔抗人雌激素受体（estrogen receptor，ER）、孕激素受体（progesterone receptor，RP）一抗购自美国Cell Signaling；羊抗兔二抗、多聚甲醛、石蜡、柠檬酸缓冲液和苏木精等免疫组化试剂购自北京中杉金桥生物技术公司。

1.3 实验方法

1.3.1 miR的提取与miR反转录 miR的提取按照Hipure FFPE miRNA Kit操作说明提取；miR反转录按照ReverTra Ace ToYoBo qPCR RT Kit 操作说明进行。qPCR 反应：上游引物分别为U6F、miR206，下游引物共同为miR27-R。反应条件：95 ℃3 min；95 ℃3 s，55 ℃，30 s，读FAM 荧光数值，40 循环；30 ℃30 s。miRNA 成熟序列及引物序列，见表1。以参照基因U6 和miR-206 基因作为标准，采用2-△△Ct方法进行计算。

表1 miRNA成熟序列及引物序列

1.3.2 免疫组化检测乳腺癌组织ER、RP表达 使用免疫组织化学检测(即用型超敏二步法)：（1)烤片后二甲苯浸泡，再用酒精逐级浸泡切片以水化组织，PBS 冲洗。（2）枸椽酸钠缓冲液微波加热至98 ℃，再把切片放入，小火处理；从缓冲液中取出玻片，以PBS冲洗。（3）为了阻断内源性过氧化物酶活性，将切片滴加3% H2O 去离子水，37 ℃孵育，PBS冲洗。（4）滴加一抗4 ℃冰箱过夜，室温下放置复温，用PBS 冲洗。（5)滴加聚合物辅助剂37 ℃孵育，PBS冲洗。（6)滴加Poly-HRP anti-Rabbit IgG(羊抗兔IgG 多聚体)，37 ℃孵育，PBS冲洗.（7）滴加DAB溶液，用显微镜控制显色的时间，自来水冲洗终止。（8）复染、脱水、透明、封片。光学显微镜下观察染色结果，由两名副高职称的病理医生进行结果判定。ER、PR 阳性标准为：≥1%肿瘤细胞核阳性，根据阳性细胞数比例分为：0～25%为（+），26%～50%为（++），51%～75%为（+++），75%以上为（++++）。

1.4 随访

采取门诊复查或电话随访，随访时间截止至2017年12月。失访10例，90例患者随访满36 个月，随访率为90%。主要观察指标为乳腺癌无病生存率（DFS，即从明确诊断为乳腺癌开始至疾病复发的时间）。

1.5 统计学方法

采用SPSS 20.0 统计软件分析数据，计量资料以均数±标准差（）表示，组间比较采用t检验；相关分析采用Spearman 相关分析，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ER、PR在乳腺癌组织中的表达

ER、PR染色位于乳腺癌细胞的细胞核，其表达强度的不同，可呈浅棕色至深棕色，见图1、图2。100例乳腺癌患者中，ER 表达阳性77例，阳性率77%。PR表达阳性66例，阳性率66%。

图1 乳腺癌组织中ER 染色阳性结果（左图）和阴性结果（右图）(免疫组化×200)

2.2 乳腺癌组织中miR-206 的表达与临床病理参数的关系

腋窝淋巴结阳性乳腺癌患者癌组织中miR-206表达水平低于阴性患者（P＜0.05）；在乳腺癌患者中，miR-206在肿瘤直径≥2.0 cm癌组织中的表达水平低于肿瘤直径＜2.0 cm 者，腋窝淋巴结移患者miR-206表达水平低于无转移患者，Ⅰ、Ⅱ期相比Ⅲ期患者，miR-206表达量水平上调（P＜0.05），见表2。

图2 乳腺癌组织中PR 染色阳性结果（左图）和阴性结果（右图）(免疫组化×200)

表2 miR-206表达与乳腺癌临床病理参数的关系

2.3 乳腺癌组织中miR-206 和ER、PR 表达的相关性

乳腺癌组织中miR-206 和ER 表达呈负相关关系（r=-0.274，P＜0.05）；miR-206 与PR 表达无相关性（P＞0.05），见表3。

表3 乳腺癌中miR-206和ER、PR表达相关性

2.4 乳腺癌组织中miR-206 表达和DFS 之间的相关性

对乳腺癌患者进行36个月的追踪随访，以miR-206相对表达中位值2－△△Ct=-2.12作为截断值，Kaplan-Meier 分析表明，癌组织中miR-206 低表达者，DFS 下降；无病生存时间低表达组平均33.3 个月(95%CI：31.9～34.7)，高表达组平均35.3 个月(95%CI：34.6～35.9)，两组比较差异有统计学意义(χ2=4.381，P=0.036)，见图3。

图3 miR-206表达水平与DFS的关系

3 讨论

乳腺癌是一种激素依赖型肿瘤，临床上也多依据癌组织ER、PR的表达情况，来制定乳腺癌患者内分泌治疗方案及评估预后[3]。miRNA通过癌基因或抑癌基因的方式参与了乳腺肿瘤细胞的生长发育及信号转导过程，并且部分miRNA经基因芯片分析显示其具有激素应答功能[4]，这均提示miRNA的研究有望为评估乳腺癌患者预后和预测内分泌治疗敏感度提供一项可靠指标。

研究发现miR-206 为抑癌基因[5-7]，在多种恶性肿瘤中均表达下调，原理可能为miR-206作用于cyclinD2、Notch3等蛋白抑制乳腺癌细胞增殖转移，同时还下调ERa 以及ERa 共调节蛋白的mRNA 和蛋白表达[8-9]。本课题组结果显示，miR-206 与乳腺癌的肿瘤大小、分期及淋巴结转移等因素密切相关，并与患者DFS 呈正相关关系（P＜0.05），说明miR-206 的表达下降，乳腺肿瘤的迁移和侵袭能力可能降低，提示miR-206 对乳腺癌的发生发展起到抑制作用。

miR-206 对乳腺癌细胞ER 的表达可能起到负调控作用：(1)Chen 等[10]发现ERα 受体的mRNA3’UTR 端有两个miRNA-206 结合位点，miRNA-206与位点结合后，导致ERα受体数量下调。(2)近期报道提示将miR-206 转染入雌激素依赖的乳腺癌MCF-7 细胞系中，癌细胞ERα 表达下调[11]。本研究结果显示，miR-206在乳腺癌组织中的表达与ER的表达呈负相关关系（P＜0.05），这与既往研究报道一致，预示miR-206 可作为一项新指标评测乳癌患者内分泌治疗的敏感性，指导临床医师制定个体化治疗方案。本研究通过对miR-206 和PR 进行相关性分析，发现二者无相关性（P＞0.05），可能与miR-206的作用机制有关，多项研究发现miR-206 主要通过下调ER 调节蛋白、mRNA 表达[9]，或直接作用于Notch3、Cdc42等蛋白，从而抑制癌细胞增殖、迁移，未经过PR及相关作用途径。

本研究的结果提示，miR-206 有可能成为新一代的乳腺癌肿瘤标志物，可用于乳腺癌的预后评估及内分泌药物敏感度判断，帮助患者合理的选择治疗方案，提高患者生存率。目前最新报道认为miR-206可能是乳腺癌患者由内分泌治疗不敏感型转化为敏感型的开关[12]，这一特性使其可能作为乳腺癌内分泌治疗的基因切入点，进一步研究可让miRNA在乳腺癌患者中更具临床价值。