国产化学发光免疫试剂检测TRAb的性能评估及临床应用价值

周建平，宋晓龙，常 琳，王改琴，李伟妮，杨 茹（陕西省人民医院放免中心，西安 710068）

毒性弥漫性甲状腺肿（又称格雷夫斯病，简称Graves 病）是一种自身免疫性甲状腺疾病，系由多种因素引起的甲状腺激素分泌增多，进而导致甲状腺功能紊乱的内分泌疾病[1]。发病率逐年升高，大约有3%的女性和0.5%的男性会罹患Graves 病[2]。Graves 病的致病机制是患者体内存在针对促甲状腺激素受体(thyrotropin receptor，TSHR）的自身抗体（thyrotropin receptor antibody，TRAb），TRAb与TSHR 结合，可导致甲状腺功能亢进和甲状腺肿。TRAb 根据其功能特征可分为三种类型：中性TRAb，阻断性TRAb 以及刺激性TRAb。其中，仅刺激性TRAb，即刺激性甲状腺免疫球蛋白（TSI）具有持续诱导甲状腺信号传导的活性[3]。大量研究表明，TRAb 与Graves 病的发生发展密切相关[4-7]，准确检测TRAb水平对于疾病的鉴别诊断及预后判断具有重要价值[8-10]。

常用的TRAb检测方法有生物测定法和免疫测定法。生物测定法能够区分抗体类型，但操作繁琐、费时[11]。免疫测定法操作简便，更利于临床广泛应用。随着化学发光免疫分析技术（chemiluminescence immunoassay，CLIA）的成熟和普及，自动分析检测TRAb 已成为趋势。目前，国内普遍采用德国罗氏公司生产的全自动电化学发光免疫分析系统（electrochemiluminescence immunoassay，ECLIA）检测TRAb[12-13]，但由于其检测成本高，某些罕见的高浓度内源性生物素会干扰检测结果[14]，因此限制了基层临床实验室的使用。为了降低医疗成本，更好地普及TRAb检测，采用具有自主知识产权且性能良好的国产TRAb检测试剂盒就具有一定的社会和经济意义。

本研究拟对郑州安图生物工程股份有限公司提供的TRAb检测试剂盒（CLIA 法）的分析性能及临床应用价值进行初步评价，同时与罗氏Anti-TSHR检测试剂盒（ECLIA 法）进行平行比对，以期为国产检测试剂的临床应用提供一定参考依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象 收集2019年6～12月在陕西省人民医院内分泌科就诊的168例甲状腺疾病患者的血清样本。其中Graves 病患者121例，桥本氏甲状腺炎患者22例，非自身免疫性的良性甲状腺结节肿患者19例，分化型甲状腺癌患者6例。另外选取同期医院60例健康体检者血清样本作为健康对照组。病例组和健康对照组血清样本均置于-20℃保存。

1.2 仪器与试剂 罗氏Cobase 601 全自动电化学发光仪（德国Roche Diagnostics 公司）及配套Anti-TSHR检测试剂（批号：40819201）；AutoLumo A2000 Plus 全自动化学发光仪（郑州安图生物工程股份有限公司）及配套TRAb检测试剂（批号：20200630）。甲状腺刺激性抗体国际标准品（NIBSC；货号：08/204）。

1.3 方法

1.3.1 精密度：参考美国临床实验室标准化协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）EP15 A3的评价方案，选取低、高两个浓度水平的患者样本，每个样本连续测定5天，每天重复测定5次，共得到25个数据，计算重复性及实验室内不精密度。

1.3.2 特异度：选择浓度接近TRAb 零值的血清样本，向样本中分别添加相应阳性物质，制备含2 000 IU/ml的甲状腺球蛋白抗体（thyroglobulin antibody，TgAb）、2 000 IU/ml的甲状腺过氧化物酶抗体（thyroid peroxidase antibody，TPOAb）、1 000 mIU/L的促甲状腺激素（thyroid stimulating hormone，TSH），10 000 IU/L的促黄体生成素（luteinizing hormone，LH）、10 000 IU/L的促卵泡生成素（follicle stimulating hormone，FSH），50 000 IU/L的人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG）的干扰样本，检测干扰样本中TRAb水平，重复测定2次。

1.3.3 正确度：选择接近空白限的血清样本（≤0.3 IU/L）稀释甲状腺刺激性抗体国际标准品，得到高、低两水平，浓度分别为20.0 IU/L和5.0 IU/L的国际标准品，并重复测定3次，分别计算实测浓度均值与理论浓度的相对偏差。

1.3.4 线性范围：参考CLSI EP06 评价方案，选取一份高值（H）和一份浓度接近于零值（L）的血清样本，将两份样本按照不同比例混合：5H，4H+1L，3H+2L，2H+3L，1H+4L，5L。每个浓度样本测定3次，并计算均值，按照平均斜率法得出回归方程Y= aX+b（Y为均值，X为理论值），要求斜率a 应在0.95～1.05 之间，且r2＞0.95，同时a 与0 比较差异无统计学意义。

1.3.5 参考区间：化学发光法TRAb检测试剂参考区间为0～2.0 IU/L。参考CLSI EP28-A3C 评价方案，选取20例健康体检者血清样本（男女各半），检测TRAb水平。所得20个数据中，如有不超过2个数值在初始采纳的参考区间外，则认为该参考区间可有效应用于本实验室。

1.3.6 方法学比对：将收集的228例患者血清分别在安图AutoLumo A2000 Plus 全自动化学发光仪和罗氏Cobase 601 全自动电化学发光仪上进行检测。参考EP9-A3 评价方案，通过Passing–Bablok 回归分析比较两者的相关性。将两种方法检测的实验结果根据各自的诊断界值进行定性分析，比较两者的一致性。

1.3.7 临床应用评价：比较Graves 病组、桥本氏甲状腺炎组、非自身免疫性良性甲状腺结节组、分化型甲状腺癌组及健康对照组的TRAb检测结果差异。以临床最终诊断为判断标准，评估国产CLIA试剂检测TRAb 诊断Graves 疾病的效能。

1.4 统计学分析 实验数据以均数±标准差（±s）形式表示，采用GraphPad Prism7.0 软件进行统计分析。通过Passing-Bablok 回归对两种试剂的检测结果进行相关性分析。通过Kappa检验对两者的一致性进行评估，Kappa值代表的一致性程度为：0.0～0.20极低的一致性，0.20～0.40一般的一致性，0.40～0.60 中等的一致性，0.60～0.80 高度的一致性和0.80～1.0 几乎完全一致。P﹤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 精密度评估 25次的检测结果见图1。TRAb高水平24.07±0.61 IU/L，低水平1.87±0.12 IU/L患者样本的重复性（CV%=2.04，6.08）和实验室内不精密度（CV%=2.62，6.50）均小于8%。

图1 两个水平血清样本检测结果散点图

2.2 特异度评估 分别测定含2 000 IU/ml TgAb，2 000 IU/ml TPOAb，1 000 mIU/L TSH，10 000 IU/L LH，10 000 IU/L FSH，及50 000IU/L hCG的干扰样本，结果均小于0.7 IU/L。表明国产TRAb CLIA试剂与以上浓度的结构类似物无明显交叉反应，分析特异度良好。

2.3 准确度评估检测高、低水平的国际标准品，相对偏差均小于6%，见表1。表明以第2 代刺激性甲状腺受体抗体国际标准品为溯源标准，国产TRAb CLIA试剂具有良好的准确度。

表1 CLIA 法检测TRAb 准确度评价

2.4 线性评估 将浓度分别为0.65 IU/L（L）和44.21 IU/L（H）的两份临床血清样本以不同比例混合后检测，检测结果见表2。回归方程斜率a为0.973 7，位于0.95～1.05 之间，且r2为0.999，大于0.99，见图2。表明国产TRAb CLIA试剂在0.65～44.21 IU/L 之间具有良好的线性。

表2 CLIA 法检测TRAb线性评估

图2 CLIA 法在0.65～44.21 IU/L 间的线性

2.5 参考区间评估 随机选取20例健康体检者的血清样本进行检测，测定最大值为1.87 IU/L，小于化学发光法检测试剂盒建议参考区间（0～2 IU/L），表明该参考区间满足本临床实验室对健康人群的筛选。

2.6 方法学比对评估 在本研究中，采用CLIA试剂和ECLIA试剂分别测定228例临床血清样本，将检测结果进行Passing–Bablok 回归分析，两种检测试剂之间呈现较好的相关性（r2=0.939 6，斜率为1.058，截距为-0.267 IU/L，P＜0.000 1），见图3。两种检测试剂的总体符合率为97.37%（222/228）。对定性检测结果进行一致性Kappa检验，Kappa值为0.947，表明两种检测试剂检测结果几乎完全一致。其中进口ECLIA试剂测定结果为阴性的111例样本中，国产CLIA试剂检测同样为阴性的有108例，另3例检测结果不一致；进口ECLIA试剂测定结果为阳性的117例样本中，国产CLIA试剂检测同样为阳性的有114例，另3例检测结果不一致。见表3。

图3 ECLIA 法和CLIA 法检测结果的Passing–Bablok回归分析

表3 ECLIA 法和CLIA 法检测TRAb 结果的定性分析

2.7 临床应用评价 国产CLIA试剂检测所有良性甲状腺结节和分化型甲状腺癌患者血清中的TRAb结果均为阴性，显示出良好的临床特异度，见图4。同时，在121例Graves 病患者中，国产CLIA试剂检测结果阳性有115例（115/121，95.04%），显示出较高的灵敏度。22例桥本氏甲状腺炎患者中有1例检测结果为阳性（1/22，4.5%）。60例健康体检者中有1例为阳性，结果为2.20 IU/L，略高于诊断界值（2 IU/L）。

图4 安图CLIA 法检测各组血清样本中的TRAb

3 讨论

TRAb是与自身免疫性甲状腺疾病相关的一种自身抗体。根据美国和欧洲甲状腺协会最新的Graves 病诊疗指南，TRAb的检测对于Graves 病的诊断及鉴别诊断具有十分重要的意义[15-16]，可作为Graves 病的筛查工具[17]。在国内临床实验室针对TRAb的检测工作中，主要采用德国罗氏公司开发的基于ECLIA的Anti-TSHR 试剂盒，该试剂盒价格昂贵，检测成本高。前期有研究报道，基于重组人TSHR 构建的TRAb检测方法比基于天然猪甲状腺滤泡膜上T SHR 构建的TRAb检测方法具有更高的灵敏度[18]。郑州安图生物工程股份有限责任公司开发的TRAb CLIA检测试剂盒，采用竞争法的原理，利用抗异硫氰酸荧光素（FITC）抗体包被磁微粒，FITC 标记的抗人TSHR 鼠单克隆抗体-人TSHR 免疫复合物作为抗原试剂，辣根过氧化物酶标记的TRAb 与样本中的TRAb 共同竞争抗原试剂中的人TSHR，从而实现检测样本中TRAb的目的。该试剂作为拥有自主知识产权的国产试剂与进口试剂相比，成本控制具有明显优势，但能否提供可靠的TRAb检测结果，是否可用于临床辅助诊断仍需进一步验证。

本研究对该国产CLIA试剂检测TRAb水平的精密度、特异度、正确度、线性范围及参考区间进行了评价，同时对国产CLIA试剂和进口ECLIA试剂检测TRAb的检测结果进行了定性及定量方面的一致性评估。研究结果显示，国产CLIA试剂检测TRAb的精密度以及特异度良好，检测结果可溯源至WHO 第2 代甲状腺刺激性抗体国际标准品。同时，国产CLIA试剂在0.65～44.21 IU/L 之间线性良好，具有较宽的检测范围。建议的参考区间适用于本临床实验室。国产CLIA试剂与进口ECLIA试剂的结果具有良好的相关性和一致性，两种检测试剂结果的总体符合率为97.37%。国产CLIA试剂检测TRAb 诊断Graves 病的灵敏度为95.04%，以上各项指标均满足本临床实验室检测要求。由于采用第二代或第三代免疫测定方法无法区分TRAb 抗体类型，故大约20%的桥本氏甲状腺炎患者因其体内存在阻断型抗体，用第二代或第三代免疫测定方法会出现阳性结果[19-20]。在本研究中，也有一例桥本氏甲状腺炎患者，国产CLIA试剂检测结果为3.75 IU/L，高于诊断界值（2.0 IU/L），这与以往研究结果一致。总之，本研究结果显示国产CLIA试剂检测TRAb 对Graves 病具有较高的诊断灵敏度，有一定的临床应用前景。但本研究也存在一定的局限性，如样本数量尤其是健康体检者样本较少，后续将收集更多的样本进行验证。此外，有文献报道西门子公司开发的TSI试剂盒（检测原理为夹心法），能够特异性检测甲状腺刺激性抗体（TSI）[21]，后续可进一步评估该国产TRAb CLIA试剂与西门子TSI检测试剂的一致性。

综上所述，国产TRAb CLIA试剂精密度和特异度良好，检测范围较宽，对Graves 病的诊断灵敏度高，能够满足临床检验需求。本研究为国产TRAb CLIA试剂在国内临床实验室的应用提供了参考依据。