多发性骨髓瘤患者血清可溶性PD-L1水平在辅助诊断及临床分型的价值研究

何 进，张 艳，申娴娟，鞠少卿（.杭州余杭嘉木护理院,杭州 30000；2.南通大学附属医院a.医学检验中心;b.临床医学研究中心,江苏南通 22600）

多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是第二常见的血液系统恶性肿瘤[1]。即使最近的治疗方案有了进步，患者通常也会产生耐药性并复发[2]。对传统治疗方法难以适应的患者预后较差。目前正在努力寻找新的治疗策略以及预测MM 耐药和预后的生物标志物[3-4]。

程序性死亡配体1（programmed deathligand 1，PD-L1），也被称为B7-H1 和CD274，是一种细胞表面糖蛋白，与T淋巴细胞上的受体程序性死亡-1（PD-1）结合，通常涉及细胞暴露于长时间的抗原刺激时，免疫反应终止，免疫衰竭[5]。在抗原呈递细胞、血管内皮细胞、胰岛细胞以及免疫特异性位点（胎盘、睾丸及眼睛）上低表达，在大量恶性肿瘤中也有表达[6]。PD-1的另一个配体PD-L2的表达受到更多的限制，活化后可在树突状细胞和巨噬细胞上发现[7]。

PD-1 和PD-L1 阻断抗体是一种很有前途的新型免疫治疗策略。在MM 中定位PD-1/PD-L1 轴的相关性已在临床前模型中得到证实，两种主要的PD-1抑制剂纳武单抗（nivolumab）和派姆单抗（pembrolizumab）以及PD-L1抑制剂度伐单抗（durvalumab）在MM 中被研究[8]。ROSSILLE 等[9]人最近发现，血液中可溶性PD-L1（sPD-L1）浓度可以预测弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）患者的总体生存期和治疗反应。目前关于sPD-L1 在MM 中的临床意义尚未十分清楚。本研究旨在检测sPD-L1 在MM患者中的表达情况，并探究sPD-L1水平在疾病辅助诊断及预测治疗反应中的价值。

1 材料与方法

1.1 研究对象 收集 2017年10月～2019年04月期间，由南通大学附属医院诊断为多发性骨髓瘤并且未接受治疗的患者65例，其中女性29例，男性36例，年龄16～85岁，平均年龄65±11岁。65例同时期健康对照者作为对照。健康组年龄20～78岁，平均年龄58±8岁。MM的诊断、分期及风险状态均按照美国国家综合癌症网络指南（NCCN）（2015年第3版，2017年第3版）。本研究经南通大学附属医院伦理委员会批准，且所有受试的患者及健康体检者均知情同意。

1.2 仪器与试剂 sPD-L1检测试剂盒（CSB-E13644h）购于武汉华美生物工程有限公司。血清LDH浓度用日立7600-020 全自动生化仪检测；β2M，κ 链和λ 链浓度用AXSYM 全自动免疫分析仪检测。

1.3 方法

1.3.1 血清标本采集与处理：用含有分离胶的真空采血管采集MM患者与健康供者外周血，室温4 000 r/min 离心8 min 分离血浆，分装于1.5 ml RNase-free的EP 管中置-80℃长期保存。

1.3.2 ELISA检测sPD-L1：每孔加入100 μl 样品或者标准品，37℃孵育2 h；去除孔内液体不洗，每孔添加100 μl 生物素标记抗体，37℃孵育1 h；洗涤3次，每孔添加100 μl 亲和素标记的过氧化物酶，37℃ 孵育1 h；洗涤5次，加入90 μl TMB，37℃避光反应30 min；加入50 μl 终止液，450 nm 波长下读数。

1.4 统计学分析 采用SPSS 软件18.0 和Graphpad Prism 6.0 软件进行分析及绘图。计量资料以中位数（四分位间）[M（P25，P75）]表示；组间比较采用Mann-WhitneyU检验；ROC曲线评估各指标单独及联合检测对MM的诊断效能。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MM患者sPD-L1的表达水平 见图1。ELISA检测MM患者sPD-L1表达水平。结果显示，MM患者组和健康对照组MM患者sPD-L1表达水平分别为1.330（0.482，3.000）ng/ml 和0.310（0.280，0.360）ng/ml，MM患者sPD-L1表达水平显著高于健康对照组（P<0.000 1）。

图1 MM患者及健康对照者sPD-L1表达水平（ng/ml）

2.2 MM患者sPD-L1 与MM 临床分期的关系 根据以下分期系统对本研究中65例MM患者进行了分期：Durie-Salmon（DS），国际分期系统（ISS）。然后，根据疾病分期对MM患者sPD-L1水平进行分析，发现与DS-I期相比，DS-II期和DS-III期患者sPD-L1表达水平无显著差异（P>0.05），图2A。ISS-II期患者sPD-L1表达水平高于ISS-I期，ISS-III期患者sPD-L1水平高于ISS-II期患者（P<0.05），ISS-I期和ISS-III期之间无显著差异（P>0.05），图2B。以上结果表明MM患者sPD-L1水平可能对MM 疾病分期具有一定的临床价值。

图2 sPD-L1 与MM 临床分期的关系

2.3 MM患者sPD-L1表达水平与临床病理特征的关系 见表1。将患者sPD-L1表达水平与临床病理参数相关联。评估sPD-L1表达水平与性别、年龄、M 蛋白、β2M，轻链、总蛋白和LDH 之间的关系。结果显示sPD-L1表达水平与β2M（P=0.033）相关。而性别、年龄、M 蛋白、总蛋白、轻链和LDH 与sPD-L1表达水平不相关（P>0.05）。

表1 sPD-L1 与MM患者临床病理参数的关系[M(P25，P75)]

2.3 sPD-L1 对MM的诊断效能评价 见图3。根据65例MM患者和45例健康对照sPD-L1，β2M，λ轻链和κ轻链的表达水平，绘制受试者工作曲线（ROC曲线），并以曲线下面积（AUC）评价诊断效能。结果显示，sPD-L1的AUC为0.789（95% CI：0.705～0.873）高于β2M（AUC：0.777；95% CI：0.697～0.856），λ轻链（AUC：0.698；95% CI：0.599～0.796）和κ轻链（AUC：0.770；95% CI：0.688～0.852）。提示sPD-L1 作为MM 辅助诊断标志物具有较好的诊断效能。

图3 ROC曲线评价各指标的诊断效能

2.4 sPD-L1，β2M 及轻链联合检测对MM的诊断价值 见表2。比较MM 和健康对照者中各指标的灵敏度、特异度和准确率。数据显示sPD-L1的灵敏度最高（83.1%），而λ轻链的特异度最高（84.6%）。将两种指标联合检测时，发现sPD-L1 和β2M组合的灵敏度最高（96.9%）。上述结果表明sPD-L1 与λ轻链，β2M 单独或者联合应用可用于MM 辅助诊断。

3 讨论

近年来，PD-1 和PD-L1 在许多疾病中的表达及作用被广泛研究[10-11]。许多学者发现PD-L1 在MM患者骨髓瘤浆细胞上过表达，但在健康供者的正常浆细胞上不表达，MM 细胞表面PD-L1表达高，骨髓瘤细胞上的PD-L1 与T细胞上的PD-1 直接相互作用，诱导其对抗骨髓瘤化疗产生耐药性[12]。

DHODAPKAR 等[13]报道了PD-L1的表达与临床MM的风险增加之间的相关性。在本研究中，我们发现与健康对照组相比，MM患者的sPD-L1水平明显升高。有研究发现健康献血者的血清sPD-L1浓度随年龄增长而增加，提示循环中的sPD-L1水平与个体免疫系统的健康有关[14]，因此，sPD-L1 可能在调节免疫活动中发挥重要作用。此外，在MM患者中，血清sPD-L1水平与β2M 相关，而与其他临床特征无关。在sPD-L1 与MM 分期的相关性分析中，发现ISS 分期较高级别的MM病人其sPD-L1的表达水平也相应较高，提示其与MM的恶性进程有一定的关系。WANG 等[15]发现血清sPD-L1水平与MM 预后的关系，包括治疗反应和疾病进展。尚不清楚sPD-L1水平升高导致MM患者预后不良的机制，但可能的解释是除了抑制肿瘤特异性CTL 细胞外，PD-L1 与PD-1 结合可通过Akt 信号通路诱导MM 细胞产生耐药性[16]。将PD-1 抑制剂与免疫调节剂联合应用于MM的临床试验获得了一定的效果，然而，关于这些组合的安全性的担忧已经被提出，一些临床试验已经被暂停或搁置，药物调节PD-L1的表达可能是治疗MM的新途径[17]。上述结果提示PD-L1是MM 治疗的潜在靶标。

我们通过ROC分析，发现sPD-L1的AUC 高于β2M，λ轻链和κ轻链，且诊断灵敏度最高，联合λ轻链，β2M 后提高了其特异度，提示sPD-L1 可能是潜在的MM 辅助诊断标志物。当然，我们的研究样本量相对较小且来自于单中心，未来的研究应该再收集不同治疗方案的患者样本，以验证sPD-L1水平与临床资料的相关性，MM 中PD-L1的作用机制仍需进一步探索。

综上所述，sPD-L1 在MM患者中的表达高于健康人群，在MM 辅助诊断和疾病分期方面有一定的临床意义。sPD-L1 诊断价值优于β2M，λ轻链和κ轻链，多指标联合检测可提高MM患者的诊断效能，提示sPD-L1 可能是MM 诊断的潜在生物指标。