HSV-TK/GCV系统在体外对胃癌MNK-45细胞株的增殖抑制作用研究

李 娅，张 赟，刘红莉，皇 海，苏明权，屈 慧（.西安市人民医院（西安市第四医院）检验科，西安 70004;.空军军医大学第一附属医院全军临床检验医学研究所，西安7003）

胃癌是人类最常见的恶性肿瘤之一。尤其在我国和东南亚地区，其发病率与死亡率居于世界癌症前列。胃癌较其它癌症相比起病较为隐匿，发现时一般都错过了最佳治疗时机。研究发现，70%的胃癌患者发现时已经处于进展期或者晚期，失去了手术治疗的机会，导致胃癌的一年生存率都很低。目前胃癌的治疗方法有多种，手术治疗、中医中药治疗以及胃癌的基因治疗等，但效果仍然不佳。

单纯疱疹病毒胸苷激酶基因（HSV-TK）/丙氧鸟苷（GCV）系统被称为前体药物激活酶，能磷酸化与核苷酸结构相似的GCV，最后形成有很强毒力的代谢产物三磷酸GCV[1]。三磷酸GCV 能够抑制细胞在分裂期基因的合成，还能够使DNA 聚合酶表达降低，对细胞产生杀伤作用[2]。

双歧杆菌属于食品安全级细菌的一种，多用于生物技术的很多方面。双歧杆菌在体内婴儿时期含量最多，随着年龄的增长而丢失。双歧杆菌具有抗衰老、抑制肿瘤、降低血糖血脂、调节免疫等功能。由于双歧杆菌具有较好的安全性，并对肿瘤组织具有靶向性，因此被广泛地应用于肿瘤临床靶向治疗的载体。

1 材料与方法

1.1 材料 pGEX-TK 和pGEX-5X-1 由本课题组前期研究所构建，胃癌MNK-45细胞株RPMI1640培养液、胎牛血清、Transwell 小室、Matrigel 胶、0.25g/dl 胰酶-EDTA 购买于Gibco 公司；Caspaase 3，Bax，Bcl-2，Actin 等购买于Abcam 公司。

1.2 方法

1.2.1 MTS 实验：①将MNK-45细胞种以5×103个细胞/孔的密度种植于96 孔板。以上细胞种植在4个96 孔板上，24，48，72 以及96h 分别观察细胞增殖情况；②在每个时间（24，48，72 以及96h）段加入MTS 试剂20μl/孔；③放入培养箱中继续孵育4h。通过酶标仪检测细胞的吸光度值（A）。计算方式依据以下公式：A实验组-A空白对照组=A相对目的。

1.2.2 CCK8 实验：运用Cell Couting Kit（CCK）试剂盒进行检测。主要方法依据说明书进行：①细胞准备：胃癌MNK-45细胞离心后细胞计数，准备铺板；②CCK 铺板：密度为5×103个细胞/孔，每组设置4个副孔，分别设置4个时间点即：CCK-24h，CCK-48h，CCK-72h 以及CCK-96h；③吸光度检测：细胞贴壁后换液，加入100μl 含有10% （v/v）CCK-8 试剂的完全培养液，孵育2 h 后，用酶标仪450nm 测定吸光度值。

1.2.3 Transwell 迁移侵袭/迁移实验：MNK-45细胞消化后收集细胞沉淀；以1×105个细胞的密度用无血清培养液悬浮后接种于小室上层，下层加入完全培养液600μl的10g/dl FBS，放入孵箱中培养；侵袭实验将稀释过的Matrigel 胶涂抹在PET 膜上；取出小室，运用4g/dl 多聚甲醛固定，时间为15min；结晶紫染色10min，PBS 清洗后自然风干，显微镜拍照计数。

1.2.4 Western blot检测：分别取各分组的胃癌细胞，弃去培养液后分别用0.01mol/L PBS 冲洗3 遍，在细胞培养皿中加入PMSF，蛋白酶抑制剂和蛋白裂解液，冰上裂解15min。转移至EP 管中离心后取上清液，通过BCA 法测定蛋白浓度。总蛋白中加入上样缓冲液，沸水中煮8 min，取50μg 蛋白上样，10g/dl SDS-PAGE 凝胶电泳分离，湿转电转膜仪转膜，5g/dl 脱脂奶粉室温（37℃）封闭1h，加入兔抗人Caspase-3（1∶500 稀释），Caspase-8（1∶1 000 稀释），Fas（1 ∶500 稀释），FAP-1（1 ∶500 稀释）和β-actin（1∶500 稀释）一抗体，室温摇床孵育过夜，TBST 洗涤3次，每次10 min，加入相应的二抗，室温摇床孵育1 h，TBST 洗膜3次，ECL增强化学发光试剂显色，成像。

1.2.5 Real-time PCR试验检测：根据Genbank 中的基因序列，使用Primer 5.0 软件设计4 对引物，由吉凯生物公司合成，引物扩增信息见表1。

表1 引物序列

运用Trizol 法提取各组细胞中的总RNA，进行逆转录合成cDNA；以cDNA为模板进行PCR 扩增。以pGEX-TK 质粒为模板，用上游引物TKF 与下游引物TKR 进行PCR 扩增。PCR 反应体系如下：总反应体积50μl，包括：2×Pfu PCR Master Mix 25μl，DNA 模板1μl，TKF 1μl，TKR 1μl，ddH2O 22μl。扩增片段大小：111 bp；设置PCR循环条件为：94℃预变性2min，94℃变性35s，63℃退火30s，72℃延伸1.5min，共进行34个循环，72℃再延伸10min。

1.3 统计学分析 统计分析运用SPSS 22.0 统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组样本数据间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t法，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 HSV-TK/GCV 对人胃癌细胞增殖活性的影响 将胃癌MNK-45细胞分为六组：空白对照组、GCV组、pGEX-5X-1组、pGEX-TK组、pGEXTK+GCV组、pGEX-5X-1+GCV组。通过CCK8（表2）以及MTS试验（表3）进行各组细胞增殖活力的检测，分别在24，48，72 和96h 观察各组胃癌MNK-45细胞的增殖活性的差异。结果发现，GCV组、pGEX-5X-1组、pGEX-TK组、pGEX-5X-1+GCV组与空白对照组相比胃癌MNK-45细胞的增殖活性并无变化。pGEX-TK+GCV组与空白对照组相比增殖活性显著降低，差异具有统计学意义（P<0.05）。

表2 CCK8试验检测HSV-TK+GCV 对人胃癌细胞增殖活性的影响

表3 MTS试验检测HSV-TK+GCV 对人胃癌细胞增殖活性的影响

2.2 HSV-TK+GCV系统对胃癌MNK-45细胞侵袭/迁移能力的影响为了观察pGEX-TK+GCV 对胃癌MNK-45细胞侵袭/迁移能力的影响，通过Transwell实验观察6组细胞模型（空白对照组、GCV组、pGEX-5X-1组、pGEX-TK组、pGEX-TK+GCV组和pGEX-5X-1+GCV组）在24h 培养后，各组胃癌MNK-45细胞的迁移活力的改变（见图1）以及侵袭活力的改变（图2）。结果发现，与空白对照组相比，GCV组，pGEX-5X-1组，pGEX-TK组，pGEX-5X-1+GCV组胃癌MNK-45细胞的迁移活力并无显著变化。pGEX-TK+GCV组与空白对照组相比其侵袭/迁移活力显著降低，差异具有统计学意义（P<0.01）。

图1 Transwell试验检测各组胃癌MNK-45细胞迁移能力的影响

图2 Transwell试验检测各组胃癌MNK-45细胞侵袭能力的影响

2.3 HSV-TK+GCV系统对胃癌MNK-45细胞凋亡的影响 通过Western blot检测了各组细胞处理48h后凋亡相关蛋白的改变，凋亡蛋白包括：Cleaved Caspase-3，Bcl-2，Bax 等蛋白，结果发现，与空白对照组相比，GCV组、pGEX-5X-1组、pGEX-TK组、pGEX-5X-1+GCV组胃癌MNK-45细胞的凋亡相关蛋白并无显著变化。pGEX-TK+GCV组与空白对照组相比其凋亡相关蛋白Cleaved Caspase-3，Bax 显著升高，Bcl-2 抗凋亡相关蛋白显著降低（见图3），提示该组细胞凋亡发生率显著增加，且P<0.01，差异具有统计学意义。

图3 Western blot试验检测各组胃癌MNK-45细胞凋亡相关蛋白的影响

2.4 Real-time PCR检测HSV-TK+GCV对人胃癌细胞凋亡相关蛋白的影响 通过Real-time PCR检测了各组细胞处理48h 后凋亡相关蛋白mRNA水平的改变（见图4），凋亡基因包括：Caspase-3，Caspase-8，Bcl-2，Bax 等蛋白，结果发现，与空白对照组相比，GCV组、pGEX-5X-1组、pGEX-TK组、pGEX-5X-1+GCV组胃癌MNK-45细胞的凋亡相关蛋白mRNA水平并无显著变化。pGEX-TK+GCV组与空白对照组相比其凋亡相关蛋白Caspase-3，Bax 显著升高，Bcl-2 抗凋亡蛋白显著降低，提示该组细胞凋亡发生率显著增加，且P<0.01，差异具有统计学意义。

图4 RT-PCR检测HSV-TK+GCV 对人胃癌细胞凋亡相关蛋白基因的影响

3 讨论

目前肿瘤的基因治疗方法研究愈发成熟，其中自杀基因相关的研究受到了广泛关注。自杀基因（suicide gene）是利用某些病毒或细菌基因的特性，在其导入靶细胞后，再运用其表达的酶催化无毒的药物前体转变为细胞毒物质的原理将靶细胞杀死，这部分基因称为自杀基因[3]。其中，HSV-TK 就是一种自杀基因[4]。HSV-TK 感染细胞后能表达TK基因，TK 能够催化GCV 磷酸化，进而抑制DNA聚合酶，抑制细胞蛋白质的合成，达到杀伤肿瘤细胞的目的[5-6]。

利用HSV-TK 在很多肿瘤的治疗中得到了验证。前列腺癌、成神经管细胞瘤以及人类乳腺癌细胞株MCF-7 运用自杀基因HSV-TK系统均能够有效抑制[7-10]。然而在胃癌中却没有报道，以胃癌MNK-45细胞为靶细胞，观察了HSV-TK系统对胃癌MNK-45细胞增殖、迁移和侵袭的作用。结果提示与对照组相比，HSV-TK系统能够有效地抑制胃癌MNK-45细胞的增殖，且具有一定的时间依赖效应，随着作用时间的延长，HSV-TK系统抑制胃癌MNK-45细胞的作用就越大。胃癌细胞在临床治疗中具有较强转移性和侵袭性，其侵袭和转移能力较高是引起术后复发的主要诱因。本研究中同样观察了HSV-TK系统对胃癌细胞侵袭和转移能力的影响，发现与对照组相比，HSV-TK系统干预能够有效降低胃癌细胞的侵袭和转移能力。从细胞的增殖、迁移和转移能力均发现HSV-TK 具有显著的干预效果。然而，研究发现人体细胞中的TK 基因并没有杀灭肿瘤细胞的功能。因此，要想外源性TK 基因在人体肿瘤的治疗中发挥作用，需要寻求一种安全、有效的载体就显得尤为重要。本实验的研究结果仅仅是体外的研究，并未进行体内胃癌的治疗，可能在体内的治疗效果上会有一定的局限性。

另外，为了进一步证实HSV-TK系统干预肿瘤细胞生长的分子机制[11-12]，本研究还观察了HSVTK系统作用后细胞凋亡相关蛋白的改变。结果显示，HSV-TK系统能够促进促凋亡蛋白caspase3的剪切以及Bax 蛋白的表达增加[13-16]，同时还能够抑制Bcl-2 抗凋亡蛋白水平的表达。提示HSV-TK系统能够促进胃癌细胞的凋亡发生，这可能是HSVTK系统抑制胃癌细胞增殖的主要机制。