基于GEO数据库对类风湿性关节炎相关基因筛选及生物信息学分析

陈龙梅，杨振华（上海市宝山区中西医结合医院检验科，上海 201900）

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA）主要累及周围关节，可导致多处周边关节畸形[1]。因机体的免疫细胞的异常增殖以及自身凋亡动态的失衡，同时激活了异常的氧化应激，导致多种信号传导通路失衡，从而引起了RA 疾病的发生发展[2]。随着大数据时代的到来，迎来了基因芯片数据的大量发展[3]，各种疾病包括RA的基因表达谱也得到了学者的重视。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一类非编码但在调控蛋白合成过程中有着不可或缺功能的RNA，它主要通过特异性地结合其他基因或蛋白质从而起到重要的生物学作用[4]。夏燕等人[5]注意到有多条lncRNA 能够影响RA患者，本研究拟通过从GEO（gene expression omnibus）数据库下载并整理有关RA的生物信息分析的lncRNA 基因微阵列数据，通过分析差异表达的LncRNA，探讨LncRNA 在RA 发生发展的作用，从而探索RA 新的治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 芯片数据来源 通过GEO(gene expression omnibus)数据库，以“Rheumatoid arthritis”为关键词搜索目标，经筛选后，采用由Xu D 等提交以GPL20115为平台的基因芯片GSE94519，包含由3例RA患者(GSM2477389～GSM2477391) 和3例健康人(GSM2477392～GSM2477394)构成的6例样本，均为LncRNA表达谱数据。

1.2 RA的差异表达基因分析 应用GEO数据库的在线分析工具GEO2R 进行分析，GEO2R 采用了R 语言中GEOquery 以及limma 程序包，再以P<0.05，|logFC>1.5|为筛选条件，挑选RA的差异表达基因。

1.3 RA差异基因的功能分析 采用DAVID 在线分析工具（https://david.ncifcrf.gov/)对差异基因开展GO 功能注释和KEGG 信号通路富集分析。GO 功能主要包括三个方面，分别是生物学过程（biological process,BP），细胞定位（cellular component,CC）和分子功能（molecular function,MF）。

1.4 RA的差异表达基因所调控蛋白互作网络与关键基因分析 通过蛋白质相互作用数据库STRING11.0（https://sring-db.org/)探索RA差异基因间编码的蛋白质间的关系，并建立它们间蛋白质互作网络（protein protein interaction network，PPI）。并将PPI结果在Cytoscape 软件中打开编辑，以cytoHubba模块计算PPI 网络节点的前10 名蛋白网络中有较高连接度的hub 基因。

2 结果

2.1 RA差异基因 根据RA差异基因的筛选条件，在GSE94519 基因芯片中共有差异表达基因278个，其中上调54个，下调224个，其火山图见图1。按照差异倍数logFC 大小排序，前三个上调基因为微管相互作用和运输1（MITD1），乙酰辅酶A 羧化酶α（ACACA），损伤特异性DNA 结合蛋白1（DDB1）；前三个下调基因为神经肽原（NPTN），原肌球蛋白α（TPM1），凝血因子XIII，A1 多肽（F13A1）。

图1 RA差异基因火山图

2.2 RA差异表达基因的GO 功能和调控通路分析 RA差异基因在DAVID6.8 中的GO 功能和KEGG 通路分析见表1。GO 功能在BP 中主要过程为血小板脱颗粒、病毒过程、氧化还原过程、GTPase 活性正调节，在CC 主要存在于胞外小体、胞浆、薄膜及细胞质，在MF 主要发挥GTPase 活性、泛素蛋白连接酶结合、钙黏蛋白结合参与细胞间黏附和GTP连接功能。调控的信号主要为调节氧化磷酸化以及帕金森病的信号通路。

2.3 RA差异表达基因所调控蛋白互作网络与关键基因分析 除去孤立无关系的蛋白节点，以RA差异表达基因构建蛋白质相互作用网络，互作关系的蛋白质共251个，构成495条复杂的PPI 网络，将网络在Cytoscape 软件中进行可视化，见图2。通过cytohubba 插件确认Hub 基因，结果显示Hub基因分别为ACTB，RHOA，PPBP，B2M，MTCYB，PF4，CFL1，MT-ATP6，VCL和TPM1，数据显示它们之间可能存在较强的相互作用关系。

3 讨论

RA 由于其高致残率而引起了社会的广泛关注，但其致病机制尚不明确[6]。RA 严重影响着患者的生活质量，所以进一步寻找有助于RA 早期诊断和治疗的分子靶点至关重要。在本研究中，我们使用了GEO2R 在线工具分析了GEO 中的芯片数据GSE94519 共包含了3例RA患者和3例健康人构成的6例样本。根据筛选条件得到了278个差异表达基因，通过DAVID6.8 对差异基因进行GO 功能注释和KEGG 信号通路分析发现差异基因主要参与了血小板脱颗粒、病毒过程、氧化还原过程、GTPase 活性正调节的转导过程和调控氧化磷酸化和帕金森病等通路。

表1 RA差异基因的GO 功能和调控信号通路的前20个基因

运用蛋白互作数据库STRING11.0 以及Cytoscape 软件分析差异基因，发现Hub 基因分别为ACTB，RHOA，PPBP，B2M，MT-CYB，PF4，CFL1，MT-ATP6，VCL，TPM1。β-肌动蛋白（β-actin，ACTB）是一种细胞骨架肌动蛋白，其蛋白表达与血小板聚集、凝血、纤维蛋白凝块形成相关[7]。RHOA 蛋白是小G 蛋白超家族的亚家族成员之一，具有GTP 酶活性，其相关的信号通路在RA患者关节成纤维样滑膜细胞(FLS)迁移、侵袭、增殖的调控作用较多地被研究[8]。原血小板碱性蛋白（Pro-Platelet basic protein，PPBP）又名趋化因子7（C-X-C motif chemokine ligand 7,CXCL7）或中性粒细胞活化肽2（neutrophil-activating peptide-2，NAP-2），为CXC 趋化因子家族的血小板衍生生长因子，能够促进淋巴细胞和内皮细胞激活，诱导炎症应答，且PPBP 在RA 滑膜液中表达出现下调[9]。B2M 基因在人体中编码β2 微球蛋白，RA患者的血β2 微球蛋白高于正常人群，这可能与RA的炎症途径有关[10]。血小板第4 因子（platlet factor 4，PF4）是由血小板α 颗粒合成的一种特异蛋白质，可促进滑漠细胞的增殖与局部抗体的产生等作用，参与RA的免疫应答和趋化因子信号通路[11]，通过与其它细胞因子相互作用介导RA 发生发展中骨及软骨的破坏。MT-ATP6是线粒体ATP 合酶亚基6 基因，它是线粒体能量合成过程中的一个关键酶，根据功能有学者预测认为MT-ATP6 具有潜在的RA 致病性[12]，筛选出的Hub 基因中MT-CYB，CFL1，VCL和TPM1 目前尚未找到相关的研究，有可能是RA 潜在的早期诊断的基因靶点，为后续的研究打下基础。

本研究是通过探索GEO数据库中的芯片GSE94519 数据，从而得到RA的Hub 基因，从而进一步研究RA的发病机制、功能和通路分析为RA的发生发展寻找新的作用靶点提供了新的思路。