头孢地尼中杂质来源分析与合成

王静，吴丹，刘龙,3*

(1.泰州医药高新技术产区园区公共平台服务中心，江苏 泰州 225300;2.广州医科大学 药学院，广东 广州 511436；3.天津佰肽特医药科技有限公司，天津 300000)

头孢地尼(Cefdinir，图1)，化学名(6R，7R)-7-[[(2-氨基-4-噻唑基)-(肟基)乙酰基]氨基]-3乙烯基-8-氧代-5硫杂-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸，是一种优良的第三代口服头孢类抗生素，由日本藤泽药品工业株式会社研制开发，于1991年首次在日本上市，商品名为：Cefzon®。1997年12月经美国食品药品监督管理局批准上市，商品名为：Omnicef®。1999年在韩国上市，2001年获批在我国上市，商品名为：世扶尼®[1-5]。

图1 头孢地尼结构Fig.1 Structure of Cefdinir

已经有很多文献报道了头孢地尼原料药的合成[6-18]，其中最常用的方法是以7-AVCA(11)和活性酯CAEM(1)为原料，以四氢呋喃和水为溶剂，在三乙胺的作用下缩合得到O-乙酰头孢地尼(12)(以下简称“杂质S”)，O-乙酰头孢地尼在氯化铵和碳酸钾的作用下水解得到头孢地尼。《中国药典》2015年版[19]和《美国药典》40版[20]均已收载该品种。《中国药典》2015年版收录的头孢地尼有关物质，对特定杂质A～S进行了定量控制，但没有对《美国药典》40版中的特定杂质噻唑乙酰基甘氨酸肟(2)进行控制。

国内外关于头孢地尼杂质的合成报道较少，部分杂质目前未见文献报道，Prasada Rao等[21]报道了《中国药典》2015年版中的杂质D(8)和杂质G(10)的合成路线，但未提供纯化方法。

因此，本文参考以上两部药典对头孢地尼有关物质的规定，基于头孢地尼的合成工艺路线，对美国药典中规定的特定杂质噻唑乙酰基甘氨酸肟(2)和《中国药典》2015年版中的特定杂质O(7)、杂质D(8)、杂质G(10)和杂质S(12)进行合成、分离和纯化，使其纯度均达到了99%以上，为头孢地尼质量控制中的杂质对照品提供了来源，极大地降低了购买对照品的成本。

1 杂质来源和合成路线

噻唑乙酰基甘氨酸肟(2)：化学名N-[(Z)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-2-(羟基亚氨基)乙酰基]甘氨酸，由头孢地尼上的β内酰胺环开环裂解产生。本研究以CAEM(1)和Gly为原料，在碱性条件下缩合，酸性条件脱除肟上的乙酰基得到产物(2)，产率为30%，纯度达到99.6%,见图2。

图2 噻唑基乙酰基甘氨酸肟合成路线Fig.2 Synthesis of Thiazolylacetyl glycine oxime

杂质O(7)：化学名(6R,7R)- 7-[(Z)-2-(2-氨基-4-噻唑基)乙酰氨基]-3-乙烯基-8-氧代-5-硫杂-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸，是由头孢地尼起始原料CAEM(1)中的杂质引入并参与后续酰化反应，得到的副产物。以2-(2-氨基噻唑-4-基)乙酸(3)为原料，经过羧基酯化，氨基Trt保护，水解酯基，羧基成酰氯，与7-AVCA(11)缩合，脱Trt保护基制得杂质O(7)，产率为11%，纯度99.2%,见图3。

图3 杂质O合成路线Fig.3 Synthesis of impurity O

杂质D(8)：化学名(6R,7R)-7-[(Z)-2-(2-氨基-4-噻唑基)-2-(肟基)乙酰氨基]-3-乙烯基-5,8-氧代-5-硫杂-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸，是由头孢地尼氧化得到的杂质。以头孢地尼为起始原料，过氧乙酸氧化得到杂质D(8)，产率为27%，纯度99.6%,见图4。

图4 杂质D的合成路线Fig. 4 Synthesis of impurity D

杂质G(10)：化学名(6R,7R)-7-[(Z)-2-(2-氨基-4-噻唑基)-2-(肟基)乙酰氨基]-3-甲基-8-氧代-5-硫杂-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸，是由原料7-AVCA中的微量杂质，参与后续反应得到的副产物。杂质G(10)与头孢地尼的合成工艺基本一致，即活性酯CAEM(1)与7-ADCA(9)在碱性条件下缩合，再经碱性水解，即可生成，产率为80%，纯度99.1%,见图5。

图5 杂质G的合成路线Fig.5 Synthesis of impurity G

杂质S(12)：化学名(6R,7R)-7-[(Z)-2-(2-氨基-4-噻唑基)-2-乙酰亚氨基乙酰氨基]-3-乙烯基-8-氧代-5-硫杂-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸(25)，简称“O-乙酰头孢地尼”。原料7-AVCA(11)和CAEM(1)缩合反应到头孢地尼，当水解不完全时，会生成杂质S。与头孢地尼的合成一致，不同的是酰化反应完成后，不经水解，立即加酸将pH调至6，析出固体，过滤，即得产物，产率80.3%，纯度99.3%,见图6。

图6 杂质S的合成路线Fig.6 Synthesis of impurity S

2 实验部分

2.1 仪器材料

核磁共振氢谱(1H NMR)用BurkerAV-300型核磁共振仪测定，TMS为内标；质谱(MS)用Agilent 1100 ESI-MS型质谱仪测定；红外光谱(IR)用Shimadzu FTIR-8400型红外光谱仪测定，固体KBr压片；熔点仪用天津市分析仪器厂RY-1G型熔点仪测定；液相色谱仪为Shimadzu LC-20A系列检测；薄层色谱(TLC)采用GF254薄层层析硅胶(青岛海洋化工厂)；柱层析采用硅胶H(青岛海洋化工厂)；合成实验所用溶剂及试剂均为化学纯或分析纯；高效液相色谱法(HPLC)所用试剂均为色谱纯。

2.2 化学合成

噻唑基乙酰基甘氨酸肟：将CAEM (5 g，13 mmol)、甘氨酸(1.95 g，26 mmol)、四氢呋喃(75 mL)、水(75 mL)加入到反应瓶中，室温下搅拌30 min。缓慢滴加三乙胺至反应液pH为8, 滴毕，室温反应36 h。体积分数10%硫酸水溶液调pH至6，析出白色固体，冰浴条件下继续搅拌1 h，析出晶体，抽滤，冷水洗涤。40 ℃真空干燥得白色粉末，二氯甲烷打浆，过滤，得类白色粉末(0.98 g，产率30%，HPLC纯度99.6%)， m.p.190～194 ℃。1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) ,δ: 1.84(s, 1H), 3.84(d,J=4.8 Hz, 2H), 6.89(s, 1H), 7.13(s, 2H), 8.73(s, 1H), 11.22(brs, 1H); ESI-MS(m/z): 245 [M+H]+; IR (KBr, cm-1)：3355, 3303, 3182, 2360, 2341, 1637, 1508, 1482, 1428, 1386, 1354, 1308, 1270, 1105, 1074, 1034, 1013, 954, 848, 749, 624, 541。

杂质O：将化合物3(5 g，32 mmol)、乙醇(88 mL)加入反应瓶中，搅拌制成混悬液，滴加浓盐酸(25 mL)，滴毕，加热回流，TLC跟踪至反应完全。降至室温，反应液浓缩至40 mL，加饱和碳酸钠水溶液(37 mL)，析出固体，过滤，水洗滤饼(30 mL×2)，40 ℃真空干燥，得白色固体。将干燥的白色固体、三苯基氯甲烷(12.1 g，48 mmol)、二氯甲烷(200 mL)加入到反应瓶中，室温搅拌30 min，滴加TEA(4.86 g，48 mmol)，继续搅拌15 h，TLC跟踪至反应完全。加水(75 mL)淬灭反应，静置分层，水层用二氯甲烷萃取(60 mL ×2)，合并有机层，减压浓缩，得粗品。硅胶柱层析分析(V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=3∶1)，得到化合物4。

化合物4 加入反应瓶，在反应瓶中加入3 mol/L氢氧化钠甲醇溶液(20 mL)，室温搅拌1 h，TLC监测反应结束。反应液用体积分数10%硫酸水溶液调pH至3.0，析出灰白色固体，过滤，滤饼水洗，40 ℃真空干燥12 h，得化合物5(5.8 g)。

在反应瓶中加入乙醚(10 mL)，催化量 DMF，冰浴条件下滴加草酰氯(2.2 g，17.4 mmol)，有气体生成，5 min后生成白色固体。反应液减压浓缩，除去乙醚，加无水二氯甲烷(10 mL)，搅拌得混悬液。反应液降温至-10 ℃，加入化合物5(5.8 g，14.5 mmol)，TLC跟踪至反应完全，得到酰氯化合物。将7-AVCA (3.3 g，14.5 mmol)、DMF(10 mL)、六甲基二硅脲(3.3 g，16 mmol)，吡啶(2.5 mL，31 mmol)依次加入到反应液中，反应液维持在-5～-10 ℃搅拌30 min。加二氯甲烷(15 mL)，水(15 mL)，室温搅拌15 min，静置分层，水层用二氯甲烷(15 mL×2)萃取，合并有机层。有机层浓缩至15 mL，加入乙酸乙酯(18 mL)，降温，析出固体，冰箱冷冻过夜，过滤，得白色固体6(4.1 g)。

98%甲酸(10 mL)加入至反应瓶中，冰浴降温至0 ℃，加入化合物6，搅拌至反应液变澄清，升温至室温，继续搅拌2 h，三苯甲基水解，过滤，得到滤饼。滤饼继续用甲酸溶解，得到澄清液体，室温缓慢加入丙酮，冰箱冷冻过夜析晶，过滤，得到滤饼，35 ℃真空干燥，得白色固体杂质O(1.26 g，产率11%，HPLC纯度98.6%)，m.p.178～180 ℃(decomp) 。1H NMR (300 MHz, DMSO-d6),δ：3.38(s，2H), 3.57&3.86(ABq，J=17.8 Hz，2H), 5.14(d，J=4.8 Hz，1H)，5.31(d，J=11.3 Hz，1H)，5.59(d，J=17.6 Hz , 1H)，5.69(dd，J=4.8 Hz、8.4 Hz，1H), 6.25(s，1H), 6.86～6.95(m, 2H), 6.90(dd,J=11.3 Hz、17.6 Hz, 1H) ，8.93(d，J=8.4 Hz，1H); ESI-MS(m/z)：367[M+H]+; IR(KBr，cm-1)：3288, 1764,1657, 1543, 1389, 1346, 1237, 1167, 1119, 711, 556。

杂质D：头孢地尼(3 g，0.007 6 mol)、水(10 mL)加入至反应瓶中，搅拌30 min制成混悬液，温度控制在10～15 ℃，加碳酸氢钠(0.96 g，0.011 mol)，反应液搅拌至澄清。降温至0 ℃缓慢滴加30%过氧乙酸(2.1 g，0.008 4 mol)，维持0 ℃搅拌2 h，体积分数10%硫酸水溶液调pH至6，搅拌1 h析晶，过滤，水洗，得灰白色固体杂质D(0.84 g，产率27%，HPLC纯度99.6%)，m.p.178～183 ℃(decomp)。1H NMR(300 MHz, DMSO-d6), δ:3.45&4.18(ABq,J=18.0 Hz, 2H), 4.94(d,J=4.0 Hz, 1H), 5.23(d，J=11.3 Hz，1H), 5.49(d,J=17.4 Hz , 1H)，5.87(dd，J=4.6 Hz，8.3 Hz , 1H), 6.71(s，1H), 6.97(dd，J=11.3 Hz, 17.4 Hz, 1H), 7.24(brs, 2H), 8.49(d,J=8.3 Hz, 1H), 11.6(brs, 1H); ESI-MS(m/z)：412[M+H]+; IR(KBr，cm-1)：3629, 3398, 2361, 2343, 1774, 1700, 1654, 1637, 1522, 1396, 1121, 1020。

杂质G：反应瓶中依次加入CAEM(2 g，0.009 mol)、7-ADCA(3.75 g，0.010 mol)、水(10 mL)、THF(20 mL)，搅拌30 min，滴加TEA(1.0 g，0.01 mol)至pH为8，室温搅拌4 h，溶液变澄清。加二氯甲烷(20 mL)，水(10 mL)，继续搅拌10 min，静置分层，二氯甲烷层用水萃取(10 mL×2)，合并水层。水层加氯化铵(1.3 g，0.025 mol)，滴加碳酸钾水溶液(0.9 mol/L)维持pH至8.0～8.5，搅拌2 h，用体积分数10%硫酸水溶液调pH至5，降温至0 ℃，固体析出，抽滤，得到滤饼， 35 ℃真空干燥，得白色固体(3-甲基头孢地尼:杂质G)(2.75 g，收率80%，HPLC纯度99.0%), m.p.179～185 ℃(decomp)。1H NMR (300 MHz , DMSO-d6)，δ：2.00(s, 3H, CH3), 3.34&3.54(ABq,J=18.1 Hz,2H),5.09(d,J=4.6 Hz, 1H,),5.70(dd，J=4.6 Hz,8.0 Hz, 1H), 6.69(s, 1H), 7.41(brs, 2H), 9.50(d,J=8.0 Hz, 1H), 11.48(brs, 1H); ESI-MS(m/z): 384[M+H]+; IR(KBr, cm-1): 3274, 3112, 2961, 1762, 1637, 1528, 1378, 1320, 1245, 1189, 1076, 1035, 1013, 750, 605。

杂质S：纯化水(12 mL)、四氢呋喃(36 mL)，7-AVCA(3 g，0.013 mol)，CAEM(5.9 g，0.016 mol)加入反应瓶，缓慢滴加三乙胺(1.6 g，0.016 mol)，使反应液pH在7.5～8.0，滴毕，室温下搅拌4 h(液相监控7-AVCA≤1%)。反应液中加入二氯甲烷(30 mL)、纯化水(30 mL)，搅拌10 min，静置分层。二氯甲烷层用纯化水(10 mL×3)萃取，合并水层。水层立即用体积分数10%硫酸水溶液调pH至3，过滤，水洗，35 ℃真空干燥，得灰白色固体杂质S(4.21 g，产率80.3%，HPLC纯度97.5%), m.p.165～170 ℃(decomp)。1H NMR(300 MHz, Acetone-d6),δ:2.2(s, 3H), 3.72&3.92(ABq,J=17.8 Hz，2H),5.33(d,J=3.2 Hz, 1H), 5.36(d,J=3.1 Hz, 1H), 5.64(d,J=17.6 Hz , 1H), 6.03(dd,J=4.8 Hz、8.6 Hz,1H),7.14(m，4H),8.84(d,J=8.6 Hz, 1H); ESI-MS(m/z): 460[M+Na]+; IR(KBr, cm-1): 3434, 3269, 3095, 2969, 1766, 1655, 1628, 1584, 1536, 1370, 1212, 1181, 1001, 918, 852。

3 结果与讨论

本研究成功制备了头孢地尼原料药成品中存在的5个关键杂质，合成路线短，操作简单。其中杂质噻唑乙酰基甘氨酸肟是采用CAEM和Gly缩合得到。杂质O以2-(2-氨基噻唑-4-基)乙酸与7-AVCA缩合再脱Trt保护基得到。杂质D是由头孢地尼直接通过过氧乙酸氧化得到。杂质G是由CAEM与7-ADCA缩合得到。杂质S采用与与头孢地尼的合成方法一致，不同的是酰化反应完成后，不经水解，立即加酸将pH调至6，析出固体得到。5种杂质均经1H NMR和MS确证了结构，纯度经HPLC测定均达到了99%以上。这些杂质的合成，为头孢地尼的质量控制提供了依据和参考，对改进头孢地尼合成工艺，提升原料药质量具有实际意义。