茜素络合物对青海湖裸鲤幼鱼的耳石标记研究

江华敏，吴金平，吴艳红，祁洪芳，周卫国，付生云，杜 浩，

(1.青海湖裸鲤救护中心，青海省青海湖裸鲤繁育与保护重点实验室，青海 西宁810016；2.中国水产科学研究院长江水产研究所，农业农村部淡水生物多样性保护重点实验室，湖北 武汉430223)

青海湖裸鲤(Gymnocypris przewalskii)属鲤科、裂腹鱼亚科、裸鲤属，是青海湖中唯一的水生经济鱼种，也是国家重点保护物种，在青海湖鱼鸟共生生态系统中发挥重要的作用。由于生态环境的恶化以及过度捕捞等因素的影响，其种群构成日益低龄化，资源面临枯竭，已严重影响青海湖及周边流域生态系统的良性循环(张金兰等，1997；史建全等，2016)。因此，开展人工增殖放流活动以恢复青海湖裸鲤种群数量与结构就显得尤为重要，截至2019年已累计放流青海湖裸鲤1龄鱼种1.56亿尾。与此相对应，放流后进行效果评价将具有重要意义。当前，青海湖裸鲤资源量和增殖放流效果的评价主要是基于青海湖的水声学调查来获得青海湖裸鲤的资源量、密度分布特征和种群数量的动态特征等相关信息(张信，2005；杨君兴等，2013)。标志放流是对增殖放流效果进行科学评估的重要手段之一(杨永宏等，2011；张雪等，2013)，但该方法在青海湖裸鲤相关的研究上仍没有得到很好的应用，尤其是青海湖裸鲤幼鱼的耳石荧光物质标记方面的研究尚属空白。

鱼的常用标记法有体外标记法、体内标记法、自然标记法、化学标记法、生物遥测法、分子遗传标记法等，其中耳石荧光标记属体外标记中的化学标记，该标记方法适合于大规模增殖放流(张雪等，2013)。1990年，Muncy等通过给鱼浸泡、投喂或注射着色剂、染料、放射性同位素、稀土化合物、金属元素和荧光化合物等无机物，探索化学标记鱼的有效方法，而今荧光标记法中的常用物质茜素络合物使用广且对于仔稚鱼效果较好。荧光标记尤其是ALC标记具有操作简单、成本低、对受标记对象伤害小、保留率高与检测直观等优点。但过高的染料浸泡及过长的浸泡时间等都可能对被标记生物产生急性或慢性毒害作用，影响被标记生物的生长、发育、行为，甚至会造成死亡(耿倩等，2016)。因此，本实验旨在探索ALC对青海湖裸鲤放流鱼种的耳石荧光标记效果，探寻适宜浸泡浓度和浸泡时间，以便为后续开展增殖放流效果评估提供技术支撑。

一、材料与方法

1.实验鱼和养殖条件

本实验在青海省西宁市的青海湖裸鲤救护中心开展，实验所用青海湖裸鲤幼鱼为中心2019年7月自行人工繁育的健康苗种(5月龄)。实验开始前，随机挑选规格一致的幼鱼[全长(7.0±0.7)厘米，个体重(3.0±1)克，总计1 800尾]作为实验鱼，在清洗消毒后的亚力克鱼缸(长32厘米×宽20厘米×高17厘米)内暂养，暂养期间连续曝气，投喂粉状饲料，每天投喂2次，换水量为养殖水体的1/4。2019年12月2日开始进行ALC对青海湖裸鲤急性毒性致死性实验，此实验期间连续曝气，不喂食。根据急性毒性致死性实验的结果，于12月9日进行标记有效性实验，标记期间连续曝气，不喂食，标记后转入循环水续养缸(长29厘米×宽4厘米×高9厘米)内恢复养殖，续养时间60天，续养期间每天投喂2次，每周换水1次，换水量占总养殖水体的1/4。在暂养及整个实验期间，水温18～20℃、pH≤8、溶氧4.83～5.18毫克/升，采用自然光照。

2.实验方法

本实验的茜素络合物为上海迈坤化工有限公司生产，规格为1克/瓶。实验分为两个阶段，第1阶段为茜素络合物对青海湖裸鲤急性毒性实验，参考罗颖等(2019)的氨氮对青海湖裸鲤急性毒性实验。使用ALC对青海湖裸鲤幼鱼进行96小时静水式急性实验，浓度分别为0、20、25、40、50、80、100、150、160、320毫克/升，并设置对照组，各组随机选择10尾鱼。持续观察96小时，及时打捞死亡个体。实验中在12、24、36、48、60、72、84、96小时分别记录标记缸中实验鱼的个体急性死亡数量，获得24、48、72和96小时的半致死浓度，计算获得96小时的安全浓度。

第2阶段为茜素络合物对青海湖裸鲤标记效果实验，依据ALC对青海湖裸鲤幼鱼的安全浸泡浓度，实验设置对照组及标记组(30、50、70、80、90、100、130毫克/升)，每组随机选择70尾鱼进行浸泡实验，在6、12、24小时分别取样20尾分组续养。续养阶段在3天和60天两个时间节点测量体重、全长，每组取样5尾解剖取出微耳石，观察标记留存率。对空白组和最高浓度组(浸泡浓度130毫克/升、时间24小时的标记组)在3、30、60天3个时间节点测量体重和全长，通过拟合线性方程判断生长差异。

3.耳石的提取、制备及检测

将测量体重、全长后的鱼苗置于双筒解剖镜下，剖开鱼苗的听囊，用镊子取出最易于分辨拾取的微耳石，用去离子水清除耳石表面的薄膜及杂质，再用无水乙醇脱水、干燥，避光保存至EP管中。使用尼康倒置荧光显微镜ti2-U的可见光、蓝色激发光、绿色激发光和紫外线光对耳石进行观察，比较最适光源，并利用显微镜自带的软件NIS-Elements AR进行图像处理。

二、结果

1.茜素络合物对青海湖裸鲤急性毒性浓度

在不同浓度的茜素络合物溶液浸泡下，根据浸泡96小时内实验鱼死亡情况，使用寇氏法计算茜素络合物在24、48、72、96小时对青海湖裸鲤的半致死浓度(LC50)，同时计算出24～96小时的置信区间，再使用Turubell公式计算安全浓度(SC)。

24小时的LC50为205.35毫克/升，置信区间为140.61～300.61毫克/升；48时的LC50为175.79毫克/升，置信区间为133.65～231.21毫克/升；72小 时 的LC50为150.66毫 克/升，置 信 区 间 为113.24～200.45毫 克/升；96小 时 的LC50为138.04毫克/升，置信区间为81.47～274.79毫克/升。SC为38.78毫克/升。

2.茜素络合物对青海湖裸鲤幼鱼的标记效果

(1)ALC在青海湖裸鲤微耳石上的印迹形态。在荧光显微镜下观察耳石上的标记效果，发现未用ALC染色组在绿色、蓝色和紫色激发光下分别呈现纯黄、纯绿和纯蓝颜色的耳石颜色。ALC染色组在绿色激发光下未能看见明显不同，整个耳石颜色仍然呈现为纯黄色。ALC染色组在蓝色激发光下，染色耳石核心部与边缘部分出现明显差异，未染色耳石边缘部仍然是纯绿，染色耳石部为蓝绿色。ALC染色组在紫色激发光下，染色耳石核心部与边缘部分也出现明显差异，未染色耳石边缘部为浅蓝色，染色成功的耳石部为淡白色。对比90毫克/升浸泡12小时后，在浸泡后3天和60天取样，可以明显看到耳石的增长，原有染色标记在60天后仍能有很好的留存。相比较而言，蓝色激发光下对耳石标志的检测效果最好。

(2)不同浓度ALC在青海湖裸鲤微耳石上的标记效果及留存率。使用蓝色激发光，观察检测不同标记浓度续养3天的实验鱼耳石，按“未见(0)”“微弱(1)”“可见(2)”“明显(3)”和“强烈(4)”5个等级记录，发现随着ALC浓度和浸泡时间的增加，荧光标记环标记率和标记强度呈现逐渐增强的趋势。再比较续养60天的实验鱼的耳石，标记效果与续养3天时取出的耳石相比，“强烈(4)”的标记效果无减退现象，耳石边缘因生长变宽而明显外移，耳石自发的绿色荧光与ALC标记环颜色对比更清晰。但低于“可见(2)”的，标记环逐渐难以辨认。在30～80毫克/升的标记浓度下，标记效果不明显，并随着续养时间加长而难以观察；90毫克/升及以上的标记浓度下标记效果加强，随着时间的加长、浓度的提高逐渐稳定，且在浸泡于90毫克/升ALC中12小时效果稳定于“强烈(4)”。

3.茜素络合物标记后对青海湖裸鲤生长的影响

对比标记组和对照组裸鲤的体重、DWG、SGR、存活率，两组之间没有显著性差异(P＞0.05)。标记期间，所有标记组和对照组实验鱼死亡率均为0，游泳能力正常，无异常行为，说明ALC标记对青海湖裸鲤产生的影响较小或者未产生影响。在共计60天的续养过程中，标记组(染色时长24小时组)和对照组在鱼体发育的成熟度上无明显差异，摄食和游泳能力皆正常。

经在3、30、60天3个时间节点测量，浓度最高的标记组(130毫克/升浓度、24小时，15尾)与空白组(无标记，15尾)鱼的生长差异不明显，标记组体重拟合线性方程为W＝0.054x＋6.85(R2＝0.9908)，全长拟合线性方程为L＝0.0958x＋2.575(R2＝0.9694)；空白组体重拟合线性方程为W＝0.05665x＋6.7783(R2＝0.9893)，全长拟合线性方程为L＝0.103x＋2.2233(R2＝0.9676)，两组裸鲤体重和全长的a值相近。

三、讨论

1.ALC对青海湖裸鲤幼鱼的安全浸泡浓度的确定

荧光标记方法因其成本低、对受试对象损伤小及标记效果好而被广泛应用于鱼的大规模标记。但标记过程中，药物的选择及适宜浓度的确定显得尤为重要，因为不同鱼对于药物的敏感度不一致，即使同种药物对不同鱼的耐受范围差异也很大(潘建雄，2019)。本实验结果表明，在水温19℃、pH≤8、溶氧4.83～5.18毫克/升的条件下，5月龄青海湖裸鲤幼鱼在100毫克/升的ALC中浸泡36小时，其死亡率为20%；150毫克/升的ALC中浸泡36小时，其死亡率为30%；320毫克/升的ALC中浸泡12小时，其死亡率为100%。存活率是衡量较适标记的条件之一。经寇式计算法计算急性毒性实验中的LC50及置信区间，本实验确定ALC浓度为90毫克/升时浸泡青海湖裸鲤幼鱼12小时是安全的。但也有研究表明，ALC浸泡虹鳟浓度为20毫克/升时就会出现大量死亡，而300毫克/升的ALC浸泡日本牙鲆时还未发生死亡。靳建波等(2011)用120毫克/升ALC溶液浸泡秦岭细鳞鲑仔鱼12小时，其成活率为92.3%；徐永江等(2016)用150毫克/升ALC溶液浸泡半滑舌鳎鱼苗36小时，其成活率为90%。这些研究结果与邱晨等(2019)使用100毫克/升的ALC浸泡48小时标记14日龄鲤仔鱼及100毫克/升的ALC浸泡5天标记鲫幼鱼，赵亚鹏等(2013)使用100毫克/升ALC浸泡标记90日龄金线鲃稚鱼24小时，何春林等(2008)使用300毫克/升的ALC浸泡12小时标记8日龄重口裂腹鱼仔鱼的研究结果不一致。上述研究结果充分表明不同的受试对象对ALC溶液浸泡浓度的敏感性不一致，这可能与实验鱼种类、规格及对茜素络合物的敏感性等因素有关。因此，对每种鱼适宜的ALC浸泡浓度与浸泡时间的确定是必要的。

2.茜素络合物对青海湖裸鲤标记效果

本实验结果表明，相同浸泡浓度下浸泡时间越长，染色效果越好。综合考虑存活率和标记率，对于5月龄青海湖裸鲤幼鱼最适标记浓度为90毫克/升，标记时长为12小时。该标记浓度下存活率和耳石标记率达100%，且显示强度均能达到“强烈”。续养60天后，在荧光显微镜下仍能观察到明显的标记环，且耳石自发的绿色荧光与ALC标记环颜色对比更加清晰，更易于观察到，这与鲤仔鱼上的研究结果相似(邱晨等，2019)，可见ALC对青海湖裸鲤幼鱼耳石的标记效果较好。

3.茜素络合物标记后对青海湖裸鲤生长的影响

适宜的标记行为对动物的生长、繁殖、生活习性没有明显的影响，故而标记放流后的回捕数据可用于对放流效果的追踪评估(刘奇，2009；马晓林等，2016)。本实验中，经ALC标记处理的青海湖裸鲤幼鱼活动等行为与空白组无明显区别，游泳能力正常。浸泡处理后，在60天的续养过程中，标记组鱼的活动及摄食等行为与空白组无显著差异。续养60天的过程中，对比标记组和对照组的体重、DWG、SGR、存活率，方差分析表明青海湖裸鲤幼鱼的生长指标在标记组和对照组间无显著性差异(P＞0.05)。在续养的30天和60天的时间节点，标记组与空白组存活率均为100%，采用直线方程(L＝a·d＋b)拟合空白组和130毫克/升浓度浸泡24小时的标记组，两组鱼体重和全长的a值相近，表明适宜浓度的ALC标记对后续青海湖裸鲤的生长和存活没有显著影响，与朱亚华等(2019)的研究结果一致。

四、小结

在本实验条件下，青海湖裸鲤5月龄幼鱼的最适ALC标记浓度为90毫克/升，浸泡时间为12小时，耳石标记在蓝色激发光下均能达到“强烈”，同时续养60天后标记仍清晰可见，且与耳石新生长的外延部分可形成明显对比。本研究结果提供了一种青海湖裸鲤幼鱼的增殖放流标记方案，可用于后期青海湖裸鲤增殖放流效果的监测。