乳腺癌外周血单核细胞自噬相关基因表达及其与肿瘤复发的关系

闫军 周高晋

复发和转移是影响乳腺癌病人预后的重要因素，其中自噬发挥重要的作用[1]。研究表明，乳腺癌组织中Beclin 1高表达，且与淋巴结转移及远处转移有关[2]。unc-51-like kinase1(ULk1)是自噬体形成的关键蛋白，ULk1蛋白阳性是乳腺癌复发的保护因素[3]。线粒体融合蛋白2(Mfn2)可调控线粒体融合、转运及线粒体自噬，抑制肿瘤细胞增殖，促进细胞凋亡[4]。研究发现，Mfn2蛋白在乳腺癌组织中低表达，与淋巴结转移及远处转移有关[5]。本研究检测了乳腺癌组织中自噬相关基因、Beclin 1、ULk1及Mfn2基因的表达与复发的关系。

对象与方法

一、对象

2013年12月～2015年6月收治的乳腺癌根治手术病人100例。均明确诊断，术前未行放化疗、内分泌治疗，临床资料完整，该研究获得医院伦理委员会批准(批号：2013-015)。排除合并其他器官肿瘤，严重精神疾病，合并严重的心肝肾疾病。病人均为女性，年龄30～74岁，中位年龄(45.34±8.23)岁；病理类型：浸润性导管癌84例，浸润性小叶癌6例，其他10例；分期：ⅡA 6例，ⅡB 52例，Ⅲ 42例；组织学分级：Ⅰ级24例、Ⅱ级36例、Ⅲ级40例；术后化疗周期：>6个72例；≤6个28例；接受内分泌治疗病人64例。病人随访5年，根据是否复发分为复发组(37例)和未复发组(63例)。37例复发病例中局部复发11例，区域复发19例，局部+区域复发7例。

二、方法

1.外周血单个核细胞(PBMC)分离：病人术前空腹抽取肘静脉血4 ml，加入同体积的淋巴细胞分离液，以300×g离心25分钟后可发现离心后管内出现细胞分层，中上层之间乳白色液面即为单个核细胞层，采用毛细吸管将该层细胞移入另一离心管，加入Hanks液清洗后保存备用。

表2 复发组及未复发组病人Atg5、Atg9、Beclin 1、ULk1及Mfn2 mRNA表达量比较

表3 乳腺癌复发的影响因素Logistic回归分析

2.Atg5、Atg9、Beclin 1、ULk1及Mfn2基因水平检测：采用RT-PCR法。Trizol溶液裂解PBMC，提取总RNA，检测RNA质量，反转录合成cDNA。引物序列见表1。随后进行PCR，反应条件：94 ℃ 5分钟；94 ℃ 30秒，56 ℃ 30秒，72 ℃ 30秒，30个循环，72 ℃延伸10分钟。每个样本均3个重复，GAPDH为内参，采用2-ΔΔCT法评估目的基因的相对水平。以2倍差异为阈值判断基因是否显著差异表达。表达倍数变化为≤2标本定义为低表达，表达倍数变化>2的标本定义为高表达。

三、统计学方法

表1 Atg5、Atg9、Beclin 1、ULk1及Mfn2引物序列

结果

1.Atg5、Atg9、Beclin 1、ULk1及Mfn2 mRNA在复发组及未复发组病人PBMC中的表达见表2。复发组Atg5 mRNA表达量高于未复发组，Atg9、Beclin 1、ULk1及Mfn2 mRNA表达量低于未复发组素(P<0.05)。

2.影响乳腺癌病人复发的Logistic回归分析见表3。结果表明，临床Ⅲ期、组织学分级Ⅲ级、Atg9、Beclin 1、ULk1、Mfn2低表达是乳腺癌病人复发的危险因素，Atg5低表达是乳腺癌病人复发的保护因素(P<0.05)。

讨论

Atg5可与Atg12、Atg16形成复合物，促进前自噬体膜的延伸和扩展，进而激活自噬[6]。研究发现，Atg5在消化道肿瘤组织中低表达，与肿瘤的进展有关[7]。Atg9是Atg家族中唯一的跨膜蛋白，缺失或下调Atg9基因的细胞自噬过程停滞。张雪梅等[8]研究发现，乳腺癌细胞中Atg9低表达，与乳腺癌恶性病理特征密切相关。

Beclin1蛋白是启动自噬的蛋白，与PI3K形成结合体，调控Atg蛋白的位置，进而加速自噬体的形成。有研究发现，人乳腺癌组织中Beclin1蛋白低表达，Beclin 1上调的MCF-7细胞增殖能力降低，侵袭性乳腺导管癌组织中Beclin 1基因低表达[9]。因此，Beclin1 基因可能是一个潜在的乳腺癌抑制基因。

ULk1是调控自噬的重要因子，可通过正向调控自噬，抑制肿瘤组织血管生成，进而抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭及转移[10]。韩赫林等[11]研究发现，ULk1蛋白低表达是乳腺癌复发的危险因素之一。还有研究发现，通过药物抑制ULk1蛋白后，肿瘤细胞的增殖能力明显升高[12]。

本研究结果显示，复发组病人Atg9、Beclin1及ULk1 mRNA表达水平低于未复发组，Atg5 mRNA表达水平高于未复发组。多因素Logistic回归分析结果显示，Atg9、Beclin 1、ULk1低表达是乳腺癌病人复发的危险因素，Atg5低表达是乳腺癌病人复发的保护因素。提示自噬在乳腺癌的复发中可能起到一定的作用。自噬相关因子在乳腺癌复发中的作用如下：(1)上述因子抑制了肿瘤细胞的凋亡，使得癌细胞免于死亡；(2)上述基因的异常表达参与了乳腺癌的恶性表型的分子机制；(3)在癌细胞与自噬相关信号之间起到桥梁作用，使肿瘤细胞开始自噬过程，延长肿瘤细胞的生存时间。

Mfn2在调控线粒体融合、维持线粒体正常形态中起作用，参与内质网应激、线粒体自噬，肿瘤细胞的增殖、凋亡等。研究发现，Mfn2在乳腺癌组织中低表达[13]，水平越低的乳腺癌病人，发生淋巴结转移机会越大，提示Mfn2与乳腺癌发展、进展有关。本研究结果显示，复发组病人Mfn2基因表达水平低于未复发组，Mfn2基因低表达是乳腺癌病人复发的危险因素。提示Mfn2与乳腺癌病人的复发有关。

综上所述，乳腺癌中Atg 9、Beclin 1、ULk1及Mfn2 mRNA低表达，Atg5 mRNA高表达， 是乳腺癌病人复发的危险因素，Atg5低表达是乳腺癌病人复发的保护因素。本研究样本量较少，尚待进一步多中心、多病例分析，评估各指标改变的临床意义。