miR-597调控FOSL2抑制乳腺癌细胞增殖、迁移及侵袭的研究

周蓓 王婧 李仲洋

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，严重影响女性的身心健康。尽管各种治疗方法取得一定进步，但长期生存率并不乐观。寻找到一种影响肿瘤细胞进展的靶向基因迫在眉睫。多项研究结果显示，乳腺癌组织或血清中微小 RNA(microRNAs)差异性表达，与病人的预后有关，如miR-199b-5p、miR-145等[1-2]。miR-597位于人类染色体8p23.1，研究发现其与结肠癌的发生发展有关[3]，但对乳腺癌的调控机制尚不清楚。FOS 样抗原2(Fos-related antigen 2,FOSL2)属于 AP-1 转录因子家族，在肿瘤增殖、细胞周期调节等过程中发挥重要的作用[4]。本研究观察miR-597对乳腺癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响，并探讨miR-597与FOSL2的关系。

对象与方法

一、对象

2018年1月～2019年4月在我院接受手术治疗的乳腺癌病人30例，年龄38～71岁，平均年龄(60.22±8.02)岁。病理分型：浸润性导管癌22例，黏液癌6例，浸润性小叶癌2例。临床分期：Ⅰ期14例，Ⅱ期10例，Ⅲ期6例。所有病人均经病理明确诊断，前3～5个月内均未进行任何抗肿瘤治疗。术中切除的癌组织及正常乳腺组织(30例，距离癌灶边缘5 cm)迅速液氮冻存以提取RNA用于qRT-PCR检测。所有标本收集均征得病人或家属同意并签署知情同意书。本研究经我院伦理委员会批准。

表1 目标引物序列和大小

二、方法

1.主要试剂、细胞株及仪器：人乳腺癌细胞系T-47D,SK-BR-3,MDA-MB-231,MCF7及 BT-474，正常乳腺细胞株MCF10A(上海生命科学研究所)。miR-597引物序列，miR-597 mimics、miR-NC对照质粒(上海生命科学研究所)；兔抗人FOSL2、β-actin多克隆一抗、鼠抗兔单克隆二抗(Sigma公司，美国)；RNA提取试剂盒，转染试剂盒(武汉博士德生物公司)；氯化丙定(propidium iodide,PI)(BDBiosciences，美国)；荧光素酶检测试剂盒(BioVision公司，美国)；MTT试剂盒(Kapa Biosystems，美国)；Transwell小室、PCR试剂盒(Sigma公司，美国)；酶标仪(上海仪电分析仪器有限公司)；ABI 7900PCR扩增仪(上海仪电分析仪器有限公司)；FACS流式细胞仪(BDBiosciences，美国)。

2.实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)检测乳腺癌组织及细胞株中miR-597、FOSL2 mRNA表达：取癌组织以及正常乳腺组织研磨粉碎，胰酶消化组织，离心，取上清。取对数生长期的细胞，胰酶消化，离心。利用Trizol试剂提取细胞总RNA，测定RNA浓度，将合格的总RNA转录成cDNA，然后进行PCR扩增。上海生工有限公司根据Gene Bank序列合成目标引物序列(表1)，根据反应要求配置反应体系，包括SYBR® Premix Ex TaqTM(2×)12.5 μl+上下游引物10 μM各1 μl，加反应水至总体积为25 μl。反应参数设置为92 ℃ 20秒、96 ℃ 2秒、85 ℃ 20秒、80 ℃ 6秒，共30个循环，75 ℃读取荧光，构建溶解曲线。2-△△Ct法计算目标引物mRNA的相对表达量。

3.细胞培养、转染及分组：含10% FBS和青、链霉素各100 U/L的DMEM培养基， 常规培养于37 ℃，5% CO2培养箱。使用P5RHH搭载miRNA形成纳米复合物进行转染，根据细胞转染物质分为：NC组(转染miR-NC空质粒)，miR-597组(转染miR-597-mimics)。转染的细胞继续培养，用于后续实验。

4.MTT法检测各组细胞增殖能力：分别消化、收集各组细胞，调整浓度为5×107/L的单细胞悬液，接种于96孔板中，每组设置5个复孔，置于培养箱中0,48小时,72小时及96小时，终止前每孔加入20 ml MTT，继续培养4小时，上机前吸弃培养液，每孔加入150 ml DMSO，水平摇床摇动30分钟，在酶标仪(490 nm波长)上测量吸光度OD值。

5.流式细胞术检测细胞周期：胰酶消化，离心细胞，调整浓度为5×105/L的单细胞悬液，接种于6孔板中，每组设置5个复孔，加入0.2% 小牛血清培养48小时，加入10 μl PI避光条件下4 ℃孵育1小时，流式细胞仪测定，ModFit软件分析。

6.Transwell小室实验检测细胞迁移、侵袭能力：采用无Matrigel基质胶和有Matrigel基质胶的Transwell小室分别进行细胞迁移和侵袭实验。迁移实验：上室每孔加入200 μl无血清细胞悬浮液，密度为6×104个/孔，下室加入600 μl含20%血清培养液，培养48小时，4%多聚甲醛固定10分钟，0.5%结晶紫染色10分钟。洗涤，光学显微镜下选取5个视野计算细胞数量。侵袭实验：使用4 ℃的无血清DMEM 1∶6稀释基质胶，每个transwell小室中加40 μl Matrigel基质胶，37 ℃放置30分钟。取出小室吸取多余的液体，其余步骤同迁移实验。

7.Western Blot检测FOSL2蛋白量表达：去除培养基，PBS洗涤，加入裂解液，冰浴30分钟，40 ℃ 1 500 r/min离心5分钟，吸去上层液体，超声波破核，再次离心，取上层液体10 μl待测。配胶，上样，电泳，转膜，切膜，封闭液封闭1小时，逐次兔抗人FOSL2、β-actin多克隆一抗、鼠抗兔单克隆二抗(1∶100)。曝光成像，Image Lab Software测定光密度[5]。

A 乳腺癌组织、正常乳腺组织中miR-597表达；B 乳腺癌细胞株、正常乳腺细胞株细胞中miR-597表达。与乳腺癌组织比较，aP<0.01；与MCF10A比较，bP<0.01

8.荧光素酶实验验证miR-195与FOSL2的靶向关系：按照试剂盒步骤将FOSL2野生型或突变型的荧光素酶报告基因质粒载体单独转入细胞，培养48小时后去除培养液。PBS洗涤3遍，加入细胞裂解液。4 ℃振荡10分钟，40 ℃ 1 000 r/min离心3分钟，取上清进行发光测定。

三、统计学方法

结果

1.乳腺癌组织及细胞株中miR-597表达：乳腺癌组织miR-597水平低于正常乳腺组织，乳腺癌细胞株细胞miR-597表达低于正常乳腺细胞株细胞，差异有统计学意义(P<0.05)。乳腺癌细胞株T-47D、SK-BR-3、MDA-MB-231、MCF7及BT-474细胞miR-597表达低于正常乳腺细胞，其中MDA-MB-231细胞表达最低。因此，本研究选取MDA-MB-231细胞株用于随后的实验研究。见图1。

2.miR-597过表达对细胞增殖能力的影响：miR-597组细胞miR-597水平高于NC组，差异有统计学意义(t=16.256，P=0.000)，表明转染成功，可用于后续实验。MTT结果表明，miR-597组细胞活力明显低于NC组，差异有统计学意义(t=9.833，P=0.000)。流式细胞术结果表明，miR-597组G0G1期细胞百分率(62.82%)高于NC组(30.19%)，S期细胞百分率(19.19%)低于NC组(40.13%)，差异有统计学意义(t=10.215，10.336，P=0.000，0.000)。

3.miR-597过表达对细胞侵袭、迁移能力的影响：miR-597组细胞侵袭能力低于NC组，差异有统计学意义(t=8.404，P=0.000)。miR-597组细胞迁移能力低于NC组，差异有统计学意义(t=5.801，P=0.016)。见图2。

4.miR-597过表达对FOSL2蛋白表达的影响：miR-597组细胞FOSL2表达水平低于NC组，差异有统计学意义(t=13.658，P=0.000)。见图3。

5.FOSL2为miR-597直接调控的靶基因：生物学信息分析表明，miR-597与FOSL2之间存在连续的结合片段。荧光素酶实验验证结果显示，miR-597 mimics可抑制野生型3'UTR报告载体荧光素酶活性，而对突变型3'UTR报告载体荧光素酶活性没有明显的抑制作用。见图4。

讨论

近年来发现多种microRNAs分子乳腺癌组织或细胞株中差异性表达，参与肿瘤的发生发展[2-3]。焦东晓等[6]研究发现，miR-199b-5p在乳腺癌组织中低表达，与乳腺癌的病理分期、淋巴结转移、预后等有关。另外研究结果显示[7]，miR-340可靶向调控MUO10基因，

A 侵袭能力实验；B 迁移能力实验。与NC组比较，aP<0.01;与NC组比较，bP<0.01

A Western Blot检测两组FOSL2蛋白表达；B 统计学分析。与NC组比较，aP<0.01

图4 miR-597与FOSL2的靶向关系

抑制乳腺癌细胞的增殖、侵袭及转移。miR-597位于人染色体8p23.1，研究发现 miR-597在结肠癌，鼻咽癌中低表达，而在急性髓细胞白血病中高表达[8-10]。有研究结果表明，乳腺癌组织中miR-597低表达，与肿瘤的恶性病理特征、预后不良有关[11]。我们采用Qrt-PCR检测了乳腺癌组织及细胞株中miR-597表达情况，结果发现，miR-597在组织及细胞株中均下调，这与其他人研究结果一致[11]，提示miR-597可能作为抑癌基因，参与了乳腺癌的发生。miRNA在肿瘤增殖、迁移及侵袭中的作用已经得到研究证实。miRNA作为抑癌基因，可调控细胞周期，阻碍细胞的增殖，失活信号通路进而抑制细胞的侵袭、转移。本研究结果提示，过表达miR-597可抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖、侵袭及转移能力，提示miR-597与乳腺癌的恶性进展有关。

FOSL2在其他多种生理和病理过程中也有一定的作用，如周期调节，肿瘤形成和纤维化。多项研究表明，FOSL2在多种肿瘤中差异性表达，如Guo等[12]研究结果显示，凋亡的白血病细胞FOSL2的水平明显升高；另外的研究发现，肝癌组织中FOSL2蛋白高表达，敲除FOSL2的肝癌细胞增殖能力受到抑制，相关癌基因(CCR4、MYB和MDM2)表达水平降低[13]；Li等[14]研究表明，FOSL2蛋白的过度表达会增加卵巢癌细胞侵袭潜能。FOSL2蛋白可能通过上调TGF-β信号通路增强肿瘤细胞的侵袭、转移能力。我们通过生物信息软件分析发现miR-597与FOSL2存在互补的基因片段，提示两者存在一定的联系。随后我们观察了miR-597 对FOSL2蛋白表达的影响，结果显示，转染 miR-597 mimic的MDA-MB-231细胞FOSL2表达下降，提示miR-597的表达抑制了乳腺癌细胞中FOSL2蛋白的表达，两者存在调控作用。随后双荧光素酶结果提示，转miR-597 mimics可抑制野生型3'UTR报告载体荧光素酶活性，进一步验证了miR-597可靶向调控FOSL2蛋白，进而影响乳腺癌细胞的恶性发展行为。

综上所述，miR-597在乳腺癌中低表达，可靶向调控FOSL2抑制乳腺癌细胞的增殖、侵袭及迁移能力，但FOSL2调控肿瘤恶性行为的通路尚不清楚，有待进一步研究明确。