CUR-SS-PEG-HA前药胶束制备及其还原敏感控释性能评价

彭佳佳,黄赛朋,闫宇斌,蒋 萌,高 婷,薛伟明,温惠云

(西北大学 化工学院,陕西 西安 710069)

姜黄素(curcumin,CUR)是从姜科天南星科植物根茎中提取的多酚化合物,具有抗氧化、抗炎、抗感染、抗肿瘤等药理活性[1-2]。CUR通过诱导恶性肿瘤细胞分化和凋亡来抑制肿瘤细胞生长，发挥抗肿瘤作用,在肿瘤治疗中具有药理安全性高和抗多药耐药等优点。但是CUR水溶性差、光热稳定性不足、代谢速度快、半衰期短等问题严重影响了抗肿瘤临床应用效果[3]。近年来,研究者通过设计胶束[4]、脂质体[5]、聚合物纳米粒[6]等实现了疏水性药物的物理负载与递送,不仅能改善药物水溶性和稳定性,而且能借助载体靶向肿瘤细胞递送[4-5]以降低药物毒副作用和提高生物利用度。

为了提高疏水性抗肿瘤药物在纳米载体中的装载稳定性,一种可行策略是通过二硫键将药物共价键合在聚合物分子上并构建还原敏感型前药聚合物胶束[7-8]。利用肿瘤细胞中还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)含量高于正常细胞约4倍的环境特征[9],递送至肿瘤细胞中的载药胶束在GSH还原作用下发生二硫键断裂,引起胶束解聚和药物释放[10-11]。

研究表明,多种肿瘤细胞能够在细胞膜上过度表达CD44受体蛋白[12-13],该蛋白可以与透明质酸(hyaluronic acid,HA)发生特异性结合，可以利用HA构建聚合物纳米胶束的亲水骨架[14],通过HA与CD44受体蛋白之间的特异性结合,引导胶束向肿瘤细胞表面迁移并促进细胞对胶束的内吞,赋予胶束具有主动靶向肿瘤细胞递送药物特性。

聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)又名乙二醇聚氧乙烯醚,具有良好的水溶性、生物相容性和可生物降解性,可在体内长循环输运,在药物载体构建研究中具有优势[15]。重复单元的存在使PEG具有多种分子量形式。Shan等研究了相对分子质量分别为1 000，2 000和5 000的PEG对pH敏感型聚合物胶束药物递送的影响,发现采用PEG2000构建的聚合物胶束具有载药量高、不易被巨噬细胞摄取、药物缓释特征明显的特点[16]。

本文以HA和PEG为聚合物材料,通过酰胺化反应将模型药物CUR通过二硫键连接到聚合物分子骨架上,合成兼具疏水端和亲水骨架的CUR-SS-polymer前药分子,利用分子自组装效应构建前药聚合物纳米胶束,对其还原敏感刺激响应控释性能进行评价。

1 实验

1.1 主要实验试剂与仪器

姜黄素(CUR,分析纯,北京伊诺凯科技有限公司);胱胺二盐酸盐(分析纯,上海笛伯化学品技术有限公司);丁二酸酐(SA,分析纯,天津福晨化学试剂有限公司);还原型谷胱甘肽(GSH,分析纯,上海国药试剂有限公司);1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl,分析纯,阿拉丁(上海)试剂有限公司);N-羟基丁二酰亚胺(NHS,分析纯,阿拉丁(上海)试剂有限公司);4-二甲氨基吡啶(DMAP,国药集团化学试剂有限公司);氨基聚乙二醇羧基2000(H2N-PEG2000-COOH,相对分子质量2000,上海梵硕生物科技有限公司);透明质酸(HA,平均相对分子量8500,山东东营佛思特生物工程有限公司);透析袋MD25(截留相对分子质量(MWCO)为3500 和10000,上海绿乌科技有限公司)。

VERTEX70红外光谱仪(德国布鲁克公司);UV-3600紫外分光光度仪(日本岛津仪器公司);Nano-ZS-ZEN3600激光粒度仪(英国马尔文仪器有限公司);HitachiH-7700透射电子显微镜(株式会社日立制作所);RF-5301PC荧光分光光度计(日本岛津有限公司);AVAE400核磁共振波谱仪(德国布鲁克公司)。

1.2 CUR-SS-PEG-HA前药分子的制备

1)HA-PEG-COOH的制备

准确称取HA (850 mg,0.1 mmol)、EDC·HCl (28.76 mg,0.15 mmol)和 NHS(17.26 mg,0.15 mmol),超声溶解于20 mL PBS缓冲溶液(pH=6.0)中,室温搅拌活化6 h后加入H2N-PEG2000-COOH (150 mg,0.075 mmol)继续反应24 h,最后将上述溶液移入透析袋(MWCO=3 500)中,在去离子水中透析48 h,冻干得白色粉末(产率54.1%)。

2)HA-PEG-SS-NH2的制备

HA-PEG-COOH (550 mg)溶于20 mL 去离子水中,加入EDC (287.55 mg,1.5 mmol)和 NHS(172.64 mg,1.5 mmol)室温搅拌活化 12 h,然后加入胱胺二盐酸盐(285.45 mg,1.85 mmol)继续反应 24 h,反应结束后在去离子水中透析(MWCO=3 500)48 h,冻干得 HA-PEG-SS-NH2粉末(产率67.3%)。

3)CUR-SS-PEG-HA的制备

SA(0.03 g,0.3 mmol)与DMAP(36 mg,0.3 mmol)超声溶解于10 mL 二甲基亚砜(DMSO)中,再与适量4A分子筛一起加入三口烧瓶(50 mL)中,N2氛围65℃活化30 min。将CUR(110 mg,0.3 mmol)加入上述烧瓶中,65℃继续反应24 h,得CUR-COOH溶液。取上述溶液1 mL用DMSO稀释10倍后加入50 mL三口烧瓶中,同时加入20 mg EDC与10 mg NHS,室温活化12 h,随后用注射器加入甲酰胺预溶解的HA-SS-PEG-NH2(10 mg/mL,10 mL),N2氛围65 ℃反应2 d。将反应产物置于透析袋(MWCO=3 500)中,在去离子水环境中透析24 h后,冻干得聚合物粉末(产率35.7%)。

1.3 CUR-SS-PEG-HA前药分子结构表征

分别将2 mg的 HA，HA-PEG-COOH，CUR-SS-PEG-HA与200 mg KBr充分研磨,使用红外光谱仪在400～4 000 cm-1波数范围测定样品红外吸收光谱。取5 mg CUR-SS-PEG-HA 溶解于DMSO-d6中,使用AVAE400核磁共振波谱仪测定样品的核磁共振氢谱(分辨率为4 cm-1,精确度为0.01 cm-1)。

1.4 CUR-SS-PEG-HA前药胶束制备

将5 mg CUR-SS-PEG-HA前药粉末充分溶解于10 mL DMSO中,再将溶液移入透析袋(MWCO=3 500),在去离子水中透析24 h,获得聚合物前药胶束溶液,备用。

1.5 临界胶束浓度(CMC)和载药量(DLC)测定

1)CMC的测定

“我不知道他结婚了，被打出门也住过院，中途他们没来看过一次。”王燕茹表示，举报时很决绝。她在检举信中提到，黄道龙父子拥有来历不明的房产、珠宝、书画、成套的红木安居、豪华轿车及大量银行卡和现金，资产高达几千万。

采用芘荧光探针法测定CUR-SS-PEG-HA的临界胶束浓度。向12个离心管(5 mL)中分别加入100 μL含芘丙酮溶液(10-6mol/L),待丙酮完全挥发后,向各离心管中加入2 mL不同浓度的CUR-SS-PEG-HA水溶液(2.45×10-4～0.25 mg/mL),室温孵育24 h,采用荧光分光光度计在激发波长335 nm处测定溶液荧光强度。

2)DLC的测定

将CUR溶解于DMSO∶水=9∶1(v/v)的混合溶液中,利用梯度稀释获得不同浓度的CUR溶液,使用紫外分光光度计在CUR最大吸收波长425 nm处测定溶液吸光度值A。以CUR溶液浓度C(μg/mL)为横坐标,以溶液吸光度值A为纵坐标,绘制标准曲线。拟合回归方程为:C=2.6828A-0.0339,R2=0.9987。

将一定质量的CUR-SS-PEG-HA前药粉末充分溶解于DMSO∶水=9∶1(v/v)混合溶液中,在425 nm处测定溶液吸光度值并计算CUR含量。按照公式(1)计算载药量。

(1)

1.6 CUR-SS-PEG-HA前药胶束形貌表征

将CUR-SS-PEG-HA前药纳米胶束溶液滴于铜网上,待溶剂自然挥发后用10 mg/mL磷钨酸溶液染色2 min,透射电镜(TEM,100 kV)观察胶束形貌。

1.7 CUR-SS-PEG-HA前药胶束尺寸相关性能表征

1)水合粒径与表面电位

动态光散射法(dynamic light scattering,DLS)测定纳米胶束水合粒径和表面电位。

采用马尔文激光粒度仪和荧光分光光度计,在含有10 mmol/L GSH的PBS缓冲液(pH=7.4,10 mmol/L)中测定CUR-SS-PEG-HA前药胶束(0.5 mg/mL)的平均粒径和荧光强度。

1.8 CUR-SS-PEG-HA前药胶束体外释药实验

将6 mL CUR-SS-PEG-HA前药胶束溶液(1 mg/mL)装入透析袋(MWCO=10 000),分别置于80 mL含有0 mmol/L 和10 mmol/L GSH的PBS缓冲液(pH=7.4,10 mmol/L)中,37℃恒温摇床100 rpm震荡透析。隔时取出3 mL溶液,同时补充等量相应GSH浓度的新鲜缓冲液。紫外分光光度计在425 nm处测定吸光度值。根据CUR标准曲线方程计算药物累积释放率。每组实验平行测定3次。

2 结果与讨论

2.1 CUR-SS-PEG-HA前药分子合成与结构表征

以HA，PEG，CUR为制备材料,本文设计了一种利用酰胺化反应使CUR分子通过二硫键键合在聚合物分子骨架上的前药分子合成方法,工艺路线如图1所示。

图1 HA-PEG-SS-NH2(A)和CUR-SS-PEG-HA(B)合成路线Fig.1 Synthetic routes of CUR-SS-PEG-HA(A) and CUR-SS-PEG-HA(B)

图2所示HA，HA-PEG-COOH，CUR-SS-PEG-HA红外光谱测定结果表明,3种样品在3 690～3 020 cm-1处均出现O-H伸缩振动宽峰;1 610 cm-1归属为HA中羧酸盐的CO伸缩振动峰,该特征峰在HA-PEG-COOH和CUR-SS-PEG-HA样品中略有蓝移;CUR-SS-PEG-HA样品在1 283 cm-1和1 411 cm-1分别出现酰胺键中C-O和C-N伸缩振动峰。CUR-SS-PEG-HA样品在1 604 cm-1出现CO(烯醇)伸缩振动峰,证明CUR被成功键合。

采用1H-NMR技术进一步证实了CUR-SS-PEG-HA前药分子的合成。图3结果表明,1.99×10-6～2.00×10-6，6.67×10-6～7.03×10-6，3.77×10-6处的峰分别归属为HA(乙酰基,-NHCOCH3)，CUR(芳香氢)，聚乙二醇(亚甲基,-CH2-CH2-O-)的质子峰;3.83×10-6处的单峰归属为CUR中-OCH3的质子峰；7.39×10-6～7.43×10-6处的二重峰归属为CUR苯环附近的质子峰；8.11×10-6处归属为聚合物分子中酰胺键质子峰。

图2 HA，HA-PEG-COOH，CUR-SS-PEG-HA的红外吸收光谱Fig.2 FT-IR spectrum of HA,HA-PEG-COOH and CUR-SS-PEG-HA

2.2 CUR-SS-PEG-HA前药胶束粒径与形貌表征

图4结果表明,采用DLS法测定CUR-SS-PEG-HA前药胶束的平均水合粒径为438 nm,PDI为0.017,粒径分布均一。胶束的Zeta电位为-23.5 mV,表明胶束间较大的静电斥力是维持胶束稳定单分散的重要因素[17]。TEM观测到胶束呈球形,平均粒径约100 nm。

图3 CUR-SS-PEG-HA的核磁共振氢谱图(DMSO-d6)Fig.3 1H-NMR spectrum of CUR-SS-PEG-HA in DMSO-d6

图4 CUR-SS-PEG-HA前药胶束粒度分布(A)与TEM照片(B)Fig.4 Size distribution (A) and TEM image (B) of CUR-SS-PEG-HA

2.3 CUR-SS-PEG-HA临界胶束浓度和载药性能

采用芘荧光探针法测定CUR-SS-PEG-HA纳米胶束CMC为0.098 mg/mL,这一特性为载药胶束在体液输运环境中维持稳定胶束结构提供了保障。载药量测定结果可见,100 mg胶束中可负载19.74 mg CUR,表明本文制备工艺能够实现药物在胶束中的稳定键合与高效负载。

2.4 CUR-SS-PEG-HA前药胶束还原敏感性能

本文在模拟肿瘤细胞内高浓度GSH环境中评价了CUR-SS-PEG-HA前药胶束结构的还原敏感特性。作为还原剂,溶液中的GSH将前药分子中的二硫键还原为巯基,导致前药分子疏水端CUR脱落,继而引起胶束结构膨胀和解聚。因此,将CUR-SS-PEG-HA前药胶束置于10 mmol/L GSH溶液中,胶束平均粒径随还原反应时间延长而显著增大(见图5),溶液荧光强度显著增强(见图6),表明本文制备的前药胶束具有优异的GSH还原敏感性能。

图5 GSH还原反应时间对CUR-SS-PEG-HA胶束粒径的影响Fig.5 Influence of GSH reduction time on size of CUR-SS-PEG-HA micelles

图6 GSH 还原反应时间对CUR-SS-PEG-HA胶束溶液荧光强度的影响Fig.6 Influence of GSH reduction time on fluorescence intensity of CUR-SS-PEG-HA micelles

2.5 CUR-SS-PEG-HA前药胶束还原敏感药物释放

实验评价了体外释放环境中GSH含量对CUR-SS-PEG-HA前药胶束还原敏感释放行为的影响。图7结果表明,当释放环境中不含有GSH时,前药胶束在100 h实验过程中的CUR累积释放率低于8%;当GSH浓度增加至10 mmol/L时,CUR在释放介质中的累积释放率显著增加,100 h时CUR累积释放率达到56.53%。这是由于构成胶束的前药分子在GSH还原作用下通过断裂二硫键引起CUR释放,表明CUR-SS-PEG-HA前药胶束对GSH具有还原敏感刺激响应的药物控释特性,图5和图6中实验也支持了这一结论。

图7 GSH含量对CUR-SS-PEG-HA前药胶束还原敏感释放行为的影响Fig.7 Effect of GSH content on reduction dependent release behavior of CUR-SS-PEG-HA prodrug micelles

3 结论

本文以HA和PEG作为聚合物亲水骨架,以CUR作为疏水端分子,通过化学键合方式构建了具有还原敏感释放特性的CUR-SS-PEG-HA前药胶束,改善了CUR的装载稳定性和负载效率。该前药胶束表现出优异的GSH还原敏感刺激的尺寸响应行为与药物控制释放行为,为肿瘤治疗研究与应用提供了可行性良好的研究思路和方案。