双酶法制备条浒苔鲜味肽工艺研究

刘冰，周振，李若敏，赵行，盘赛昆，2，3，王文彬,2,3*

(1.江苏海洋大学 食品科学与工程学院，江苏 连云港 222005；2.江苏海洋大学江苏省海洋生物产业技术协同创新中心，江苏 连云港 222005；3.江苏省海洋资源开发研究院，江苏 连云港 222005)

鲜味肽作为一种可增强食物鲜味和醇厚味的呈味肽，具有易于加工、鲜味明显以及营养丰富等特点[1]，主要由蛋白酶水解或氨基酸合成获得[2]。而浒苔作为制作鲜味剂的原料，必需氨基酸含量丰富，是一种高蛋白、低脂肪、矿物质含量丰富的海藻[3]。以浒苔鲜味肽为基料制成的复合调味剂是满足当下调味品对兼具调味与营养双重功效的需求[4]。

本试验以宁波的条浒苔为原料，以鲜味的感官评价及水解度为考察指标，筛选出胰酶与风味酶进行复配，在各自单因素的基础上采用均匀试验确定双酶添加顺序、酶解温度及复配比例，并通过响应面进一步优化双酶酶解浒苔提取鲜味肽的工艺，得到最优工艺条件。采用超滤膜分离技术得到分子量不同的3个组分，对各自组分进行鲜味评价以及肽含量测定，为后期浒苔鲜味肽深加工提供了理论基础，从而开辟出新的鲜味调味剂原料来源[5]。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

条浒苔产于宁波，洗净烘干备用。

纤维素酶(5.0×104U/g)、中性蛋白酶(2.2×104U/g)、胰蛋白酶(3.4×104U/g)、风味蛋白酶(2.1×104U/g)、木瓜蛋白酶(2.2×104U/g)、复合蛋白酶(4.1×104U/g)：河南圣斯德实业有限公司；聚乙二醇(6000)：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)：分析纯，福州飞净生物科技有限公司；其他试剂：均为国产分析纯试剂。

ZNC-701超微粉碎机 北京华仪高科电气有限公司；CMD2000/4湿法超微粉碎机 切可(上海)机械设备有限公司；Seven Easy S20 pH计 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；SHA-2数显冷冻水浴恒温振荡器 江苏金坛市亿通电子有限公司；SP-754紫外分光光度计 上海光谱仪器有限公司；DMJ60-3三级膜分离过滤系统 山东博纳生物科技集团有限公司；Ultra-15超滤离心管Amicon (MWCO 10000) Millipore公司；MD34-100透析袋 Yi Bo Biological公司；AS-LGJ-10FG真空冷冻干燥机 郑州宏朗仪器设备有限公司；电脑恒温层析柜 上海金达生化仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 工艺流程

干浒苔条→粗粉碎→湿法超微粉碎→纤维素酶酶解→灭酶(95 ℃，10 min)→调pH→加蛋白酶酶解→灭酶(95 ℃，10 min)→离心→取上清液。

操作要点：干浒苔用超微粉碎机粉碎，过80目筛，按料液比1∶20 (g/mL)加蒸馏水，于湿法超细粉碎机中回流粉碎40 min，频率40 Hz，制得浒苔匀浆保存于4 ℃冰箱备用。纤维素酶pH 3.0，加酶量5%(W/V)，温度25 ℃，振荡酶解6.5 h，98 ℃水浴灭酶10 min。

1.2.2 蛋白酶的筛选

选用中性蛋白酶、胰蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶和复合蛋白酶5种蛋白酶在各自适宜条件下酶解经纤维素酶破壁后的浒苔液，时间为1，2，3，4，5，6 h。以鲜味感官评价和水解度为指标，初步筛选出适宜酶解浒苔蛋白的双酶组合。

1.2.3 单因素试验

以鲜味感官评价和水解度为评价指标，考察加酶量、酶解时间、温度、pH及固液比这5个因素的酶解成效。

1.2.3.1 酶添加量对酶解效果的影响

在酶解温度50 ℃，胰酶pH 7.5、风味酶pH 7.0，酶解时间3.0 h，固液比1∶20 (g/mL)条件下，设定酶添加量的6个水平为500，1000，1500，2000，2500，3000 U/g·pro，分别取胰酶和风味酶酶解后的上清液进行感官评价和水解度测定。

1.2.3.2 酶解时间对酶解效果的影响

在酶解温度50 ℃，胰酶pH 7.5，风味酶pH 7.0，酶添加量2000 U/g·pro，固液比1∶20 (g/mL)条件下，设定酶解时间的6个水平为2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5 h，分别取胰酶和风味酶酶解后的上清液进行感官评价和水解度测定。

1.2.3.3 酶解pH对酶解效果的影响

在酶添加量2000 U/g·pro，酶解温度50 ℃，固液比1∶20 (g/mL)，酶解时间3.0 h条件下，分别设定胰酶和风味酶酶解pH 的6个水平为6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，分别取这两种酶酶解后的上清液进行感官评价和水解度测定。

1.2.3.4 酶解温度对酶解效果的影响

在酶添加量2000 U/g·pro，pH 7.5，固液比1∶20 (g/mL)，酶解时间3.0 h条件下，设定酶解温度的6个水平为35，40，45，50，55，60 ℃，酶解后取上清液进行感官评价和水解度测定。

1.2.3.5 固液比对酶解效果的影响

在酶添加量2000 U/g·pro，胰酶pH 7.5，风味酶pH 7.0，酶解时间3 h，酶解温度45 ℃ 条件下，设定固液比的5个水平为1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60 (g/mL)，酶解后分别将胰酶和风味酶酶解液调至同一浓度后离心取上清液进行感官评价和水解度测定。

1.2.4 均匀试验设计

以鲜味评价和水解度为检验指标，根据前期单因素试验结果，考察双酶添加顺序、双酶酶解温度和双酶复配比例这3个因素对双酶酶解效果的影响，从而确定其适宜作用条件[6]。由于双酶添加顺序有3个水平，双酶酶解温度和复配比例各有6个水平，因此考虑采用拟水平法由U6(66)构造[7]，酶解pH为7.5，酶添加总量为2000 U/g·pro，同步酶解时间为3.0 h，分步酶解时间各为1.5 h，具体因素水平见表1。

表1 均匀试验因素与水平Table 1 The factors and levels of uniform experiment

1.2.5 响应面试验设计

由于响应面法可以通过建立曲面模型对影响双酶酶解效果的因素水平及其交互作用进行评价与分析[8]。考虑采用Design-Expert的中心组合试验设计方法根据单因素和均匀设计的试验结果[9]，从酶解时间、pH、固液比和酶添加总量4个因素中选择对酶解成效影响显著的因素设计成三因素三水平的试验方案，具体因素水平见表2。

表2 响应面试验因素水平表Table 2 The factors and levels of response surface experiment

1.2.6 指标的测定

1.2.6.1 鲜味感官评价

a.评定方法

采用定量描述分析法对浒苔酶解液进行感官品评。感官品评在温度为(25±2) ℃的感官评价室进行，10位感官评定员在感官评定之前均经过专业培训，熟悉浒苔酶解产物的风味特征和感官强度，进行培训的参比溶液为谷氨酸钠(0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 g/L)。评定成员用蒸馏水漱口之后，取待评样品 5 mL 置于口中，10 s 后吐出，漱口后取参比液品尝，根据感官评定标准(见表3)对此次感官结果给予记录，结果取10人评定值的平均值[10]。

表3 感官评判标准 Table 3 The sensory evaluation standard

b.待评定样品处理

取浒苔酶解液经10000 Da超滤离心管离心后，装入100 Da透析袋中，在盛有一定量聚乙二醇的培养皿中浓缩2 h至聚乙二醇完全溶解，将浓缩后的酶解液置于层析柜中，4 ℃透析脱盐1 h，用盐度计测量其盐度，并调整至同一盐度水平。

1.2.6.2 水解度测定

参考张丽华的方法，酶解液中氨基态氮含量计算公式见式(1)：

式(1)

式中：X为样品中氨基态氮浓度(mg/mL)；V1为样品滴至pH 9.2所消耗的标准NaOH体积(mL)；V2为空白滴至pH 9.2所消耗的标准NaOH体积(mL)；C为NaOH标准滴定溶液浓度(mol/L)；14.008为消耗碱量换算为氮的系数；V为测定用样品溶液体积(mL)。

水解度计算公式见式(2)：

式(2)

式中：X为水解后生成的氨基态氮含量；N为样品总氮含量。

1.2.6.3 不同分子量肽段初步分离与鲜味评价

通过超滤膜分离系统的陶瓷膜将酶解上清液中的浒苔多糖去除后，依次经过有机膜MWCO 10000和MWCO 3000，分离得到3个不同的组分，分别命名为：组分Ⅰ(Mw>10 kD)、组分Ⅱ(3 kD

1.2.7 肽含量的测定

采用双缩脲法检测溶液中的多肽含量。标准曲线的回归方程为Y=0.0373X+0.032，R2=0.9989。

1.3 统计分析

2 结果与分析

2.1 筛酶试验

在固液比为1∶20、加酶量为1500 U/g ·pro时，分别在5种蛋白酶的最适条件下酶解6 h，每1 h取样测一次，条浒苔蛋白的水解进程曲线见图1。

图1 不同蛋白酶对条浒苔蛋白水解度的影响Fig.1 The effects of different proteases on the hydrolysis degree of Enteromorpha clathrata protein

由图1可知，选取的5种蛋白酶对浒苔蛋白酶解均表现出一定的酶解效果，对比各种蛋白酶的酶解效果，结果表明胰蛋白酶的水解度最高，中性蛋白酶次之，复合蛋白酶最低。条浒苔蛋白水解的速率不一致，可能是由于蛋白酶的水解催化点不同。

图2 不同蛋白酶的水解物感官评价分值Fig.2 The sensory evaluation scores of hydrolysates of different proteases

由于不同的酶具有不同的生物活性成分，作用的肽键也不相同，酶解条浒苔蛋白得到的肽链结构和长度是不同的，其滋味也可能不同，若单纯地追求高水解度指标，可能会导致酶解液的感官品质不高，所以在筛选制备浒苔鲜味肽的适宜酶种类时，还应该考察酶解物的鲜味评价。在固液比为1∶20、加酶量为1500 U/g·pro时，木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶、复合蛋白酶5种蛋白酶在各自适宜条件下水解6 h，反应结束后对其进行感官鉴定。由图2可知，5种酶解液在1～3 h鲜味是随时间的延长有所增加，酶解超过3 h后，鲜味逐渐下降。

由于胰蛋白酶水解度较高，水解液感官评价分值较低；风味蛋白酶水解度较低而感官评价分值较高，其中胰蛋白酶为肽链内切酶，风味蛋白酶既是内切酶同时也是外切酶，因而考虑将这两种酶进行复配，从而在不降低水解度的条件下得到具有较高鲜味品质的水解液。

2.2 单因素试验

2.2.1 酶添加量的影响

图3 加酶量对水解度和鲜味感官评价的影响Fig.3 The effects of enzyme additive amount on the hydrolysis degree and umami sensory evaluation

由图3可知，当加酶量小于2000 U/g·pro时，条浒苔胰酶酶解液和风味酶酶解液的水解度都随着酶添加量的增大而升高，当酶添加量达到2000 U/g·pro时，水解度都达到最大值，其中，胰酶达到15.12%±0.6%，风味酶达到10.25%±0.4%。两种酶解液的鲜味也是先升后降，在2000 U/g·pro时最鲜。之后，随着加酶量的增加，底物浓度小于所加酶的浓度，溶液中的蛋白酶因此产生竞争，发生自溶从而使蛋白酶活力下降，水解度和鲜味也随之降低。综上所述，胰酶和风味酶酶解条浒苔的添加量都以2000 U/g·pro较为适宜。

2.2.2 时间的影响

图4 时间对水解度和鲜味感官评价的影响Fig.4 The effects of time on the hydrolysis degree and umami sensory evaluation

由图4可知，两种蛋白酶酶解条浒苔时，随着时间的延长，水解度都呈先上升后下降的趋势。这是由于反应初期底物都被两种蛋白酶充分酶解，水解度显著上升，达到3 h后，底物减少且两种酶的活性逐渐丧失，反应速率下降，水解度增加放缓并趋于平衡。而两种酶的水解液的鲜味则呈先升后降的趋势，在3 h达到最鲜，感官评分为3.75±0.49和6.75±0.5。鲜味下降是由于随着时间的延长，酶解液的酸味逐渐加重，影响甚至掩盖了其中的鲜味，因而感官评分逐渐下降。综上所述，胰酶和风味酶酶解条浒苔的时间都以3 h较为适宜。

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2.2.3 pH的影响

图5 pH对水解度和鲜味感官评价的影响Fig.5 The effects of pH values on the hydrolysis degree and umami sensory evaluation

pH的变化会影响蛋白结构的稳定性，对酶解反应效果影响较为显著。由图5可知，胰酶pH在达到7.5之前，水解度和鲜味随着pH增加而上升，而pH超过7.5之后，水解度和鲜味都有十分明显的下降。这说明胰蛋白酶在pH超过7.5的环境下容易失活使底物不能得到充分酶解。鲜味的下降可能是因为pH对胰蛋白酶催化条浒苔蛋白基团的解离状态产生影响，使水解液中的正负基团以及疏水基团不能满足产生鲜味的要求，从而使评分明显下降。风味酶在pH达到7.0之前，水解度和鲜味呈上升趋势，pH超过7.0后，水解效果以及酶解液的鲜味都降低。综上所述，胰酶酶解条浒苔的pH以7.5较为适宜，而风味酶酶解条浒苔的pH以7.0较为适宜。

2.2.4 温度的影响

图6 温度对水解度和鲜味感官评价的影响 Fig.6 The effects of temperatures on the hydrolysis degree and umami sensory evaluation

由图6可知，随着温度的上升，两种酶酶解液的水解度和鲜味都呈先升后降的趋势，在温度为45 ℃时两种酶解液的水解度和鲜味都达到最大值。这是因为蛋白酶有其适宜的温度，在未达到该温度时胰蛋白酶和风味蛋白酶的活性都不高，与底物接触较少；而超过该温度时，蛋白酶结构都遭到破坏，活力下降，水解度与鲜味都下降。综上所述，胰酶和风味酶酶解条浒苔的温度都以45 ℃较为适宜。

2.2.5 固液比的影响

图7 固液比对水解度和鲜味感官评价的影响Fig.7 The effects of solid-liquid ratios on the hydrolysis degree and umami sensory evaluation

由图7结合预试验可知，当底物较浓时胰蛋白酶和风味蛋白酶的活性受到抑制且多糖析出较多，使得酶解液在离心后都呈凝胶状，鲜味较弱。当固液比达到1∶20时两种水解液的水解度和鲜味都达到最大值。当底物浓度低于1∶20时，水解度和鲜味都呈下降趋势，但差异不显著。综上所述，胰酶和风味酶酶解条浒苔的固液比都以1∶20较为适宜。

2.3 均匀试验设计和结果分析

依据预试验结果可知双酶的添加顺序和复配比例对双酶酶解效果的影响较大，且单因素试验结果表明温度对胰蛋白酶和风味蛋白酶的酶解效果影响都较为显著，因此需选择合适的试验设计来确定双酶添加顺序、复配比例以及温度这3个因素的适宜作用条件。若采用正交试验设计，为保证试验点的整齐可比，需进行多次重复试验，试验量较大，而均匀试验可以较少的试验次数较准确地反映各因素的试验条件，且与正交试验相比若初步确定的各因素作用范围不够准确，均匀试验设计可以求得现有范围之外的最佳水平组合[11]。本试验选择U6(66)表，共进行6组试验，以鲜味评价和水解度为指标，权重系数分别为0.6和0.4，采用综合评分法对酶解效果进行综合评分[12],试验结果及方案见表4。

表4 均匀试验设计和结果Table 4 The uniform experiment design and results

考虑到因素间的交互作用，对表4进行二次多项式逐步回归分析，得回归方程：Y=-4.9945+0.3591X2+0.2092X3+0.0780X12-0.0039X22，其相关系数R=1.0000，F=24999.8125>F0.01(4,1)=563 ，显著水平P=0.0021，剩余标准差S=0.0003，调整后相关系数Ra=1.0000，决定系数R2=1.0000，方程通过检验，对该模型各项进行显著性检验，结果见表5。

表5 二次多项式逐步回归模型各项显著性分析Table 5 The significance analysis of quadratic polynomial stepwise regression model

由表5可知，模型中的各项对响应值的影响都是极显著的。其中主效应只有X1对响应值没有显著性影响，但X1的平方项对响应值是有显著影响的，这说明对双酶酶解效果的影响主要是因素的主效应，而不是各因素间的交互作用。

经DPS 7.05数据处理系统优化后，结合实际和生产操作的可行性得到3个因素各自最适宜条件为：双酶同时添加、温度46.5 ℃、胰酶∶风味酶2∶1，在此条件下模型的预测值为4.48，实际综合评分为4.44，用SPSS进行T检验，P=0.762>0.05，与预测值无显著性差异，模型可靠。

2.4 响应面设计和结果分析

2.4.1 响应面试验设计方案及结果

条浒苔酶解工艺各因素间存在交互作用，依据单因素方差分析和均匀试验分析的结果，为确定最佳工艺，选择酶解时间、pH和总酶添加量3个因素，采用Design-Expert 8.0的Box-Behnken中心组合来设计试验方案，结果见表6。

表6 响应面试验设计和结果Table 6 The response surface experiment design and results

2.4.2 回归方程拟合和方差分析

利用Design-Expert 8.0软件对试验结果进行二次多项式回归拟合，得到鲜味感官评价与各因素二次回归方程模型为：Y1=7.31-0.35A-0.33B-0.33C-0.33AC-0.29BC-0.67A2-0.75B2-0.27C2。

表7 鲜味感官评价方差分析表Table 7 The variance analysis of umami sensory evaluation

回归模型系数R2=0.9620，P<0.0001，模型显著，失拟项P=0.3298,不显著，说明方程拟合较好，试验误差较小。校正系数RAdj2=0.9241，表明该模型可以解释92.41%响应值的变化，可用该方程来描述各变量与响应值之间的关系。对回归模型进行显著性检验，由表7可知，一次项对鲜味的感官评价影响都极显著；二次项除了加酶量C2影响显著，其余都具有极显著性影响；交互项只有AC、BC影响显著。参照F值可知，时间(A)>加酶量(C)>pH(B)。

水解度对时间(A)、pH(B)、加酶量(C)的回归模型方程为：Y2=22.43+0.062A+0.30B+0.22C-0.38AB+0.87BC-0.29A2-1.26B2-0.69C2。

表8 水解度方差分析表Table 8 The variance analysis of hydrolysis degree

回归模型系数R2=0.9668，P<0.0001，模型显著，失拟项P=0.1469，不显著，说明方程拟合较好，试验误差较小。校正系数RAdj2=0.9337，表明该模型可以解释93.37%响应值的变化，可用该方程来描述各变量与响应值之间的关系。对回归模型进行显著性检验，由表8可知，一次项中pH(B)对水解度有极显著影响，加酶量(C)有显著影响，而时间(A)影响不显著；二次项除了时间A2是影响显著，以其余都具有极显著性影响；交互项中BC对水解度影响极显著，AB影响显著。参照F值可知，pH(B)>加酶量(C)>时间(A)。

2.4.3 响应面分析

固定3个因素其中之一，考察其他2个因素的交互作用对浒苔双酶酶解效果的影响。根据回归方程绘制出响应面及等高线图(见图8～图11)，可直观反映各参数对响应值的影响。

图8 加酶量和反应时间对鲜味感官评价的交互作用及等高线Fig.8 Interaction effect and contour between enzyme additive amount and reaction time on umami sensory evaluation

图9 加酶量和反应pH对鲜味感官评价的交互作用及等高线Fig.9 Interaction effect and contour between enzyme additive amount and pH value on umami sensory evaluation

图10 反应时间和反应pH对水解度的交互作用及等高线Fig.10 Interaction effect and contour between reaction time and pH value on hydrolysis degree

图11 加酶量和反应pH对水解度的交互作用及等高线Fig.11 Interaction effect and contour between enzyme additive amount and pH value on hydrolysis degree

由图8可知，在pH不变的情况下，感官评价随着时间和加酶量的上升都呈先增后降的趋势，且曲面都较陡，影响较显著。由等高线图呈椭圆形且在数值较大时较密可得加酶量和时间的变化对酶解液鲜味影响较大，交互作用显著。

由图9可知，pH和加酶量曲面都较陡，对鲜味感官评价的影响都显著。由等高线图可知，pH和加酶量较小时，等高线较平缓，其数值变化对鲜味影响较小；而在较高范围内，等高线比较陡峭，说明因素数值变化对鲜味影响较大，由此可知加酶量和酶解pH之间交互作用显著。

由图10可知，pH曲面较陡，时间曲面较平缓，说明pH较时间对水解度的影响更显著。等高线图呈椭圆形且在pH轴处更密表明pH值的变化对水解度影响更大，酶解pH与时间的交互作用较强。

由图11可知，固定时间不变时，水解度随着加酶量和pH的增加先升后降，且曲面都较陡，有较显著影响。等高线图呈椭圆形，在pH和加酶量值较小时，等高线较稀疏，对水解度影响较小；而在较高范围内等高线较密集，表明加酶量和pH对水解度影响较大，两者交互作用显著。

2.4.4 工艺条件的优化与验证

利用Design Expert 8.0.6.1软件获得了最佳双酶酶解条件的因素组合：酶添加总量1965.26 U/g·pro、pH 7.49、酶解时间2.91 h，此时模型预测的鲜味感官评价和水解度分别为7.37和22.39%。为验证响应面模型预测的准确性，以此条件做3组平行试验，测得鲜味评分和水解度分别为7.34±0.24、22.34%±0.38%，用SPSS对其进行T检验，得P1=0.846、P2=0.839，均大于0.05，无显著性差异，模型可靠。

2.5 超滤膜分离

经蛋白酶水解后的上清液中，肽分子量一般集中在100～100000 Da之间，且以亲水性肽为主，这与蛋白酶专一水解含疏水性氨基酸和碱性氨基酸残基的肽键有关[13]。采用超滤膜分离将酶解液分成3个组分，对其进行鲜味感官评价可初步估计呈鲜明显组分的相对分子质量，结果见表9。

表9 酶解液超滤前后鲜味感官评分 Table 9 The umami sensory evaluation scores of hydrolysate before and after ultrafiltration

由表9可知，超滤后各组分的鲜味存在一定差异。组分Ⅰ和组分Ⅱ鲜味评分较原酶解液显著降低，截留的鲜味较弱；而组分Ⅲ截留液鲜味的感官指标较原酶解液有所提高，这表明经过超滤膜的处理可有效提高酶解液的鲜味，这与穆利霞等[14]的研究结果一致。

2.6 肽含量测定

用分光光度计采用双缩脲法检测溶液在540 nm波长下的吸光值(OD)，代入标曲Y=0.0373X+0.032，得出各组分的肽含量，结果见表10。

表10 不同分子量酶解液肽含量测定结果 Table 10 The determination results of peptides＇ content in hydrolysate with different molecular weight

由表9和表10可知，组分Ⅲ肽含量最低,而鲜味最高，可能是由于呈鲜味的肽段大多集中于3 kD以下，而大于3 kD的组分虽然肽含量较高但可能具有其他功能的蛋白肽，并不具有鲜味，这与王莉等[15]关于具有鲜味的肽分子量在1 kD以下是一致的。

3 结论

通过对单酶水解与双酶水解工艺的研究优化出条浒苔蛋白酶最佳水解工艺为：胰蛋白酶与风味蛋白酶同步水解，温度 46.5 ℃，胰酶和风味酶比例为2∶1(酶活比)，酶添加总量1965.26 U/g·pro，pH 7.49，酶解时间 2.91 h，固液比1∶20 (g/mL)。经验证，鲜味评分达到7.34±0.24、水解度为22.34%±0.38%。与单酶水解相比，鲜味与水解度均有显著提高，也是本文的创新之处。

采用超滤膜分离技术初步分离出鲜味较强的组分，并对其进行肽含量检测，从而为鲜味调味品原料开发提供了新思路，转变了市场观念，生产出更符合当下食品发展需求的天然调味料。