18种芳香植物精油抑菌活性的比较研究

陈悦，胡璇，于福来，王凯，谢小丽，袁媛，徐子琪

(1.海南大学 林学院，海口 570228；2.中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所/海南省热带药用植物工程研究中心，海口 571101；3.广东药科大学 生命科学与生物制药学院， 广州 510006；4.山东第一医科大学第一附属医院，济南 250014)

芳香植物是指具有芳香气味且可供提取植物精油的栽培植物和野生植物[1]。我国海南岛自古以来就被称为香岛，相对于其他芳香药用植物生产省份具有得天独厚的环境和资源优势，但海南岛芳香植物的开发利用还不够深入，其生物活性有待进一步的挖掘和探索。植物精油又称挥发油或香精油，是以植物的花、叶、根茎、果实等为原料,以蒸馏、压榨、溶剂萃取等方式提炼出来的芳香味油状液体[2]。2020年年初，新型冠状病毒疫情暴发引起全世界的高度关注，在疫情防控过程中，消毒抑菌剂成为必需品。但近年来抗生素的长期使用使得致病细菌耐药性的问题日渐突出，寻求绿色、高效、安全且环保的植物抑菌原料已成为当前的研究热点[3-4]，对芳香植物精油进行抑菌活性的研究，从中寻找具有良好抑菌活性的芳香植物精油，有利于食品、医药、化妆品等行业抑菌产品的创新和研发[5-7]。基于此，本实验选择了海南岛18种常见芳香植物提取的精油，通过对5种需氧细菌进行体外抑菌效果的对比研究，初步筛选出较佳抑菌活性的芳香植物精油，为海南岛芳香植物资源的进一步开发和利用提供了一定的理论依据和参考。

1 材料

1.1 仪器

XFS-280A手提式压力蒸汽灭菌锅 浙江新风医疗器械有限公司；SW-CJ-1F超净工作台 苏州广源净化科技有限公司；DNP-9052BS-Ⅲ电热恒温培养箱 上海新苗医疗器械制造有限公司；Sartarius CPA225D电子分析天平 北京赛多利斯科学仪器有限公司；DU-800紫外-可见光分光光度计 美国贝克曼公司。

1.2 药材与试剂

18种芳香植物精油：均购自海南万宁兴隆南药植物精油馆，纯度为100%，规格均为10 mL，于4 ℃储存，其详细信息见表1。链霉素S8290：购自北京索莱宝科技有限公司；无水乙醇(分析纯)：购自国药集团化学试剂有限公司。

表1 18种芳香植物精油信息Table 1 The information of 18 aromatic plant essential oils

续 表

1.3 菌株与培养基

金黄色葡萄球菌StaphylococcusaureusATCC 6538、枯草芽孢杆菌BacillussubtilisATCC 9372、大肠杆菌EscherichiacoliATCC 25922、铜绿假单胞菌PseudomonasaeruginosaATCC 27853：由青岛大学药学院李刚老师赠送；肺炎克雷伯氏菌KlebsiellapneumoniaeBNCC 102997：购自于北京北纳创联生物技术研究院。MHA培养基(Mueller-Hinton Agar)和MHB培养基(Mueller-Hinton Broth)：均购自于北京索莱宝科技有限公司。

2 方法

2.1 供试菌悬液的制备

在无菌条件下，取甘油冻存的标准菌株金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯氏菌分别接种至MHB培养基中，37 ℃培养12 h后，于MHA培养基中划线使其能形成单个菌落，将接种平板放置于37 ℃培养24 h后，挑取典型单个菌落接种至MHB培养基中，于37 ℃培养18～24 h后，用紫外分光光度计测定菌液浓度OD600为0.5～0.6之间，检验纯度后用MHB培养基分别将各菌液稀释成1×106CFU/mL的菌悬液备用。

2.2 供试药液的制备

将18种芳香植物精油(见表1)用无水乙醇稀释配制成质量浓度为500 mg/mL的样品溶液，以溶剂无水乙醇为阴性对照，15 μg/mL的链霉素为阳性对照，实验前所有药液均用0.22 μm滤膜过滤除菌，置于4 ℃冰箱冷存备用。

2.3 抑菌圈测定

采用滤纸片琼脂平板扩散法[8]，在无菌条件下，将已灭菌并冷却至50 ℃左右的MHA培养基倒入无菌培养皿中，水平放置凝固后，用移液枪分别吸取各菌悬液200 μL于培养基平板上，均匀涂布后备用。用移液枪分别吸取2.2项下浓度的各药液20 μL滴于无菌滤纸片(d=6 mm)上，充分吸收后，将其贴在已涂布的各菌液培养基平板上，并标记好各药液的名称，每个菌重复3次，置于37 ℃培养箱中培养24 h。培养结束后，观察并记录抑菌圈的有无以及直径大小作为判断敏感度高低的标准，采用十字交叉法量取抑菌圈直径大小，取其平均值作为测定结果。结果判定按美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)颁布的《抗微生物药物敏感性试验执行标准》为标准：直径>20 mm为极敏，15～20 mm为高敏，10～15 mm为中敏，<10 mm为低敏。

2.4 最低抑菌浓度(MIC)的测定

采用微量二倍稀释法[9]，在96孔板上进行，从A1开始为第1孔，从左到右，每个板上1～10孔为药液，11，12孔分别为阴性和阳性对照，每个板只能加1种菌。首先用移液枪向每排1～12个孔各加入100 μL各菌悬液，再分别吸取2.2项下浓度的各精油样品溶液100 μL至第一孔，依次对第1～10孔做梯度稀释，使其精油浓度分别为250，125，62.5，31.25，15.63，7.81，3.91，1.95，0.98，0.48 mg/mL，11，12孔分别加入5 μL的无水乙醇溶液和3 μg/mL的链霉素溶液，充分混匀，每种细菌3个重复。最后将96孔板置于37 ℃培养24 h，培养结束后，比较检测组与对照组浑浊度差异，以无细菌生长的最低浓度为MIC。

2.5 最低杀菌浓度(MBC)的测定

采用琼脂培养基平板法，取MIC以上未见细菌生长的孔内混合液于MHA培养基中均匀涂布，在37 ℃恒温培养箱中培养24 h后，观察有无细菌生长，以菌落数不超过5个的平板所对应孔中的最低浓度为该药物的MBC。

3 结果

3.1 药敏试验

由表2可知，18种芳香植物精油对革兰氏阴性和阳性菌具有不同抑制作用，其中月桂、罗勒、香茅和马郁兰精油对金黄色葡萄球菌表现为高度敏感，岩兰草精油和广藿香精油无抑菌圈出现，其余12种精油分别表现为9种低度敏感和3种中度敏感；岩兰草精油和广藿香精油对枯草芽孢杆菌和大肠杆菌均未检测出抑菌圈，其余16种精油对枯草芽孢杆菌和大肠杆菌均表现为低度敏感和中度敏感；18种芳香植物精油对铜绿假单胞菌均具有一定的敏感反应，其中百里香精油和罗勒精油为高敏反应，其余精油分别表现为9种低度敏感和7种中度敏感；百里香、天竺葵、罗勒、依兰、香茅和马郁兰6种精油对肺炎克雷伯氏菌表现为高度敏感，广藿香精油无抑菌圈出现，其余11种精油分别表现为9种低敏和2种中敏反应。抑菌效果见图1。其中罗勒精油对5种细菌表现出的药敏作用最好，抑菌圈大小分别为金黄色葡萄球菌16.31 mm、枯草芽孢杆菌14.5 mm、大肠杆菌14.65 mm、铜绿假单胞菌16.76 mm、肺炎克雷伯氏菌17.09 mm；广藿香精油和岩兰草精油对5种细菌表现出的药敏作用较差，其中广藿香精油的敏感度最差，仅对铜绿假单胞菌具有作用，抑菌圈为8.10 mm。

表2 18种芳香植物精油对5种细菌的抑菌圈直径Table 2 The inhibitory zone diameters of 18 aromatic plant essential oils to 5 bacteria

续 表

图1 18种芳香植物精油对5种细菌的抑菌效果Fig.1 The antibacterial effect of 18 aromatic plant essential oils to 5 bacteria

3.2 MIC值测定结果

表3 18种芳香植物精油对5种细菌的MIC值(n=3)Table 3 The MIC values of 18 aromatic plant essential oils to 5 bacteria (n=3)

由表3可知，18种芳香植物精油中岩兰草精油、广藿香精油和葡萄柚精油无抑菌活性，其他15种植物精油对5种细菌均表现出不同程度的抑菌作用，MIC在0.49～62.5 mg/mL之间，其中月桂、百里香、罗勒和马郁兰精油对5种细菌的抑菌效果最强(MIC均为0.49 mg/mL)。研究结果发现不同芳香植物精油对不同细菌的抑菌强度具有一定的差异，茉莉精油对铜绿假单胞菌无抑菌活性，对枯草芽孢杆菌的抑制活性较弱(MIC为62.5 mg/mL)，但对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和肺炎克雷伯氏菌则表现出较好的抑菌活性(MIC均为7.81 mg/mL)；佛手柑精油则仅对枯草芽孢杆菌和肺炎克雷伯氏菌具有较弱的抑菌活性(MIC均为62.5 mg/mL)。

3.3 MBC值测定

18种芳香植物精油对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和铜绿假单胞菌的杀菌效果均不理想，其中仅有依兰精油对大肠杆菌具有杀菌作用，MBC值为250 mg/mL；月桂、百里香、天竺葵、依兰和马郁兰5种精油对金黄色葡萄球菌具有杀菌作用，其中百里香精油和马郁香精油的MBC值为125 mg/mL，其余精油的MBC值均为250 mg/mL；依兰、香茅和天竺葵3种精油对枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的杀菌作用相同，MBC值均为250 mg/mL。18种芳香植物精油对肺炎克雷伯氏菌的杀菌效果比较理想(见表4)，其中岩兰草、广藿香和葡萄柚3种精油对肺炎克雷伯氏菌无杀菌效果，其余15种精油的杀菌效果表现为：月桂=罗勒=马郁兰>百里香>安息香>金盏花=芹菜=依兰>罗马洋甘菊=茉莉>天竺葵>佛手柑>茶树=迷迭香=香茅。

表4 18种芳香植物精油对肺炎克雷伯氏菌的MBC值(n=3)Table 4 The MBC values of 18 aromatic plant essential oils to Klebsiella pneumoniae (n=3)

4 讨论

本研究采用体外抑菌试验方法，对海南岛常见18种芳香植物精油体外抑菌活性进行测定和分析，实验选择了5种需氧细菌，包括了革兰氏阴性和阳性菌，MIC和MBC数据与抑菌圈直径数据趋势一致，说明所选芳香植物精油中具有良好抑菌效果的精油。MIC实验中月桂精油、百里香精油、罗勒精油、马郁兰精油对5种细菌均表现出最强的抑菌性，与前人[10]报道的月桂精油具有良好的抑菌效果一致，与Singh等、丁华等报道的罗勒具有较强抑菌作用的结论相符合[11-12]；其中香茅精油对3种细菌表现出最强的抑菌性，最小抑菌浓度均为0.49 mg/mL，实验结果表明这几种芳香植物精油具有一定的广谱抑菌效果。但有些精油仅对单一细菌表现出最强的抑菌性，如安息香精油对金黄色葡萄球菌、依兰精油对大肠杆菌。MBC实验结果发现18种芳香植物精油仅对肺炎克雷伯氏菌表现出明显的杀菌作用，其中月桂精油、罗勒精油和马郁兰精油的杀菌作用最强，最小杀菌浓度均为0.49 mg/mL。肺炎克雷伯氏菌是引起肺炎的主要致病菌，属于革兰氏阴性杆菌，这一结果可为芳香植物精油在医药行业中的应用提供一定的参考。18种芳香植物精油对其他4种细菌无杀菌作用或杀菌作用弱，大部分精油对一些细菌只具有抑菌活性，不具备杀菌作用，这可能与精油的组成成分和抑菌机制相关。植物精油为一类化学成分复杂的挥发油类成分，为芳香植物的精制粗提物，不如单一化学药物具有强有力的杀菌效果，但是其绿色天然，无毒安全，来源广泛，提取工艺简单可取，其通过抑菌作用发挥生物活性，在抑菌领域仍然具有巨大的潜在应用价值[13]。

综上所述，月桂、罗勒和马郁兰3种芳香植物精油是综合抑菌效果最好的3种精油，其次是百里香精油，其他精油也对不同菌种表现出一定的抑菌活性。植物精油可以通过破坏细胞膜功能、影响脂质层稳定及溶解胞体中的脂肪体、抑制菌体中DNA和RNA等物质的合成、影响能量代谢途径和破坏细菌细胞壁结构这5种途径发挥抑菌和杀菌作用[14]。目前国内外对精油抑菌机制的报道相对较少，值得进一步的探索和深入研究，为植物精油的抑菌作用提供了理论支撑。