L-PRF凝胶结合BMSCs对ANFH兔骨陷窝与血管和骨密度影响的实验研究 ①

季庆辉,薛 宇,颜 玉,薛 勇,乔晓峰,乔建民

(佳木斯大学临床医学院，黑龙江 佳木斯 154003)

股骨头(caput femoris)是上部覆盖关节软骨2/3圆球的圆形，股骨头上部稍后有一圆形窝称为股骨头凹，其内附着股骨头韧带，股骨头可以从此处韧带动脉血管(股内侧、旋股外侧、闭孔、臀上、臀下、髂腰)获得血供[1]。股骨头由于外伤及应用皮质类固醇和酗酒引起血供不足或中断形成股骨头缺血性坏死(avascular necrosis of the femoral head，ANFH)，它是骨外科致残率很高常见病，常用治疗包括：①人工关节置换术、②非手术治疗、③保髋手术治疗、④介入治疗四种常用方法进行治疗股骨头缺血性坏死(ANFH)[2]。

富白细胞-富血小板纤维蛋白 (Leukocyte-and platelet-rich fibrin，L-PRF) 凝胶是静脉采集自体全血，通过无外源性添加剂离心浓缩制备而成[3]。富血小板含有大量生长因子，当激活时可以释放出来，生长因子具有促进骨和成骨细胞增殖、生长、分化和组织形成作用。L-PRF凝胶是富含两种自体(白细胞和富血小板)物质纤维生物材料，可以避免三种(免疫排斥、交叉感染、凝血功能障碍)风险出现，激活血小板与纤维蛋白生理性聚合，纤维蛋白网状结构富有弹性，细胞因子可以相对持久的释放，因为L-PRF凝胶与生物体生理状态相似，所以能最大限度发挥组织促进再生、愈合、修复作用[4]。

骨髓间充质干细胞(Bone Mesenchymal Stem Cells，BMSCs)是骨髓成体干细胞参与造血微环境构成，具有①多向分化、②低免疫原性、③取材方便、④扩增迅速、⑤遗传稳定等五方面主要特点[5]。骨髓间充质干细胞(Bone Mesenchymal Stem Cells，BMSCs)可以在①组织工程、②细胞、③基因治疗等方面进行应用，自体骨髓间充质干细胞(BMSCS)结合纤维蛋白可以促进骨再生修复骨缺损[6]。

L-PRF凝胶结合BMSCs对ANFH兔骨陷窝与血管和骨密度影响实验研究，主要研究探索L-PRF凝胶结合BMSCs对ANFH兔骨陷窝与血管和骨密度影响，L-PRF凝胶结合BMSCs的临床治疗ANFH提供理论依据。

1 材料和方法

1．1 实验动物

新西兰大白兔正常健康24只, 1/2雌雄，4 月龄，体重(2600±200)g,佳木斯大学实验动物中心提供新西兰大白兔[7]。

1．2 试剂与实验仪器

1．2．1 主要试剂。无水乙醇(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，25%戊二醛(山东富山东浩中化工科技有限公司)，乙酸异戊酯(天津市南金化工有限公司)，20%甲酸溶液(上海樊克生物科技有限公司)，DMEM/F12(1:1)培养基(上海源叶生物科技有限公司)，四季青胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司)，胰蛋白酶(上海第一生化药业有限公司)，牛凝血酶(上海欣百诺生物科技有限公司)，脂多糖/LPS(大肠杆菌内毒素(lipopolysaccharides)，美国 SIGMA)，甲基强的松龙(Methylprednisolone)(普强苏州制药有限公司)[8]。

1．2．2 实验仪器。常温高速离心机(湖南凯达科学仪器有限公司)，低温高速离心机(长沙高新技术产业开发区湘仪离心机仪器有限公司)，SJ-CJ-2FD 超净工作台(苏洁医疗器械(苏州)有限公司)，-15～-50℃HX-SD6急速冷冻冰箱(东莞市昊昕仪器设备有限公司)，NIKON科研显微镜 Eclipse Ci-E/Ci-L/Ci-S(日本，NIKON)，12号骨髓穿刺针(深圳丰都金属材料有限公司[9]。

1．3 L-PRF凝胶制备

正常健康新西兰大白兔后肢胫部皮下静脉处采血10mL、置于离心管(无菌)中、2500rpm/min(978×g)10min离心、静置10min取淡黄色中间层、无菌纱布吸取血清、粗制L-PRF 、无菌容器静置10min、无菌纱布包裹轻轻挤压残存血清、静置5min、L-PRF凝胶[10]。

1．4 BMSCs分离培养

在健康正常新西兰大白兔双侧髂后上棘处用12号骨髓穿刺针抽取骨髓5mL、放入DMEM/F12(1:1)培养基制成悬液、收集培养基中细胞加入2倍PBS(磷酸缓冲盐溶液)混匀、1500rpm/min,20min离心、离心分层取中间层云雾状细胞、10cm细胞培养皿、100mL/L胎牛血清培养液、接种2×105云雾状细胞、取贴壁纯化细胞、分离纯化BMSCS细胞液、稀释1×106/mL BMSCS细胞液备用[11]。

1．5 ANFH兔模型制备

健康新西兰大白兔、第一次经兔耳缘静脉注射10μg/kg大肠杆菌内毒素(lipopolysaccharides)、间隔24h、第二次经兔耳缘静脉注射10ug/kg大肠杆菌内毒素(lipopolysaccharides)、然后兔部臀肌肉注射40mg/kg甲基强的松龙(Methylprednisolone)、共3次、间隔24h/1次、42d X线检查确定模型制备完成[12]。

1．6 ANFH兔股骨头检查

1．6．1 MRI 检查ANFH兔股骨头。L-PRF凝胶结合BMSCs等各处理兔常规麻醉、仰卧位，屈曲(上、下)肢且固定、兔股骨头置MRI检查线圈中心、各处理分别进行MRI扫描检查、T2 WI出现(点、片、线)状高信号、T1 WI 出现(点、片、线)状低信号、得出相关数据。

1．6．2 定量CT(QCT)检查ANFH兔股骨头。L-PRF凝胶结合BMSCs等各处理兔常规麻醉、仰卧位，屈曲(上、下)肢且固定标准件上、对其股骨头中心定位扫描、测量股骨头骨质疏松CT值、计算骨密度(BMD[13]。

1．7 组织学检查

1．7．1 光学显微镜组织学检查

MRI检查后、L-PRF凝胶结合BMSCs等各处理兔常规处死、双侧股骨头取材标本、常规石蜡包埋切片、苏木精-伊红染色、光学显微镜高倍镜(10×40)、5个高倍视野、计数50个骨陷窝占百分数、计血管数目求平均值、数码相机拍照[14]。

1．7．2 扫描电子显微镜组织学检查

MRI检查后、L-PRF凝胶结合BMSCs等各处理兔常规处死、双侧股骨头取材标本、3% 戊二醛固定与脱钙、环氧树酯包埋切片、观察骨细胞。

1．8 L-PRF凝胶结合BMSCs对ANFH兔骨陷窝与血管和骨密度影响实验动物分组及修复方法

新西兰大白兔正常健康24只, 1/2雌雄，4 月龄，体重(2600±200)g，均造双侧ANFH 模型后随机分为A、B、C、D 4组(各6只)，然后进行移植修复。A：对照组，只进行髓芯减压；B：L-PRF组，髓芯减压结合50μg L-PRF凝胶移植同时进行；C：BMSCs组，髓芯减压结合50μL 1×106/mL BMSCS细胞液移植同时进行；D：L-PRF+ BMSCs联合组，髓芯减压结合50 μg L-PRF凝胶+50 μL 1×106/mL BMSCS细胞液移植同时进行[15]。

1．9 统计学方法

2 结果

2．1 L-PRF凝胶联合BMSCs对ANFH兔各组组织学观察

通过NIKON科研显微镜 Eclipse Ci-E/Ci-L/Ci-S进行组织学观察，L-PRF凝胶联合BMSCs对ANFH兔各组组织学观察情况，见表1。

表1 L-PRF凝胶结合BMSCs对ANFH兔各组组织学观察

2.2 L-PRF凝胶联合BMSCs对ANFH兔空缺骨陷窝百分比影响

L-PRF凝胶联合BMSCs对ANFH兔各组移植处理28d、56d，空骨陷窝观察及统计情况如下：移植处理28d：A组：空骨陷窝较多，B组：空骨陷窝与A组相比要少些，C 组：空骨陷窝较少，D 组：空骨陷窝较C 组更少；移植处理56d：A组：空骨陷窝较多，B组：空骨陷窝较A组少，C 组：空骨陷窝稀少，D 组：空骨陷窝与C 组相比更稀少。

各组移植处理统计情况如下：移植处理28d、56d，D 组：空缺骨陷窝百分比明显低于A 、B 和C 组3组，差异有统计学意义(P<0.05)。L-PRF凝胶联合BMSCs对ANFH兔空缺骨陷窝百分比影响见表2。

表2 L-PRF凝胶结合BMSCs对ANFH兔空缺骨陷窝百分比影响

2.3 L-PRF凝胶联合BMSCs对ANFH兔血管密度影响

L-PRF凝胶联合BMSCs对ANFH兔各组移植处理28d、56d，股骨头坏死区新生血管计数统计情况如下：移植处理28d、56d，C、D 组：股骨头坏死区新生血管数明显高于A、B组，B组：股骨头坏死区新生血管数多于A 组，D 组：股骨头坏死区新生血管数明显高于C组，各组相比较差异有统计学意义(P<0.05)。L-PRF凝胶结合BMSCs对ANFH兔血管密度影响见表3。

表3 L-PRF凝胶结合BMSCs对ANFH兔血管密度影响

2.4 L-PRF凝胶联合BMSCs对ANFH兔骨密度影响

L-PRF凝胶联合BMSCs对ANFH兔各组移植处理28d、56d，股骨头骨密度测量统计情况如下：移植处理28d、56d，B 组与A 组和D 组与C组比较差异有统计学意义(P<0.05)。L-PRF凝胶结合BMSCs对ANFH兔骨密度影响见表4。

表4 L-PRF凝胶结合BMSCs对ANFH兔骨密度影响

3 讨论

股骨是人体骨骼中最重要部分之一，股骨头作用非常重要，人的股骨头几方面作用：①直立、②行走、③活动、④劳动等方面均需要股骨头起到的支撑作用。因为股骨头几方面起到的支撑作用都要有力度和是支点，所以股骨头也是骨骼中最容易受伤部位。股骨头缺血性坏死(avascular necrosis of the femoral head， ANFH)最常见症状：(1)疼痛。部位：①髋关节、②大腿近侧、③膝部，可放射至膝部。(2)疼痛分类：①持续痛、②静息痛。(3)其它疼痛：①骨塌陷致创伤性关节炎、②髋关节肌肉韧带附着部位慢性损伤性疼痛。(4)髋部活动受影响：①旋转活动、②痛性、③短缩性跛行。如果发生股骨头缺血性坏死(avascular necrosis of the femoral head， ANFH)也对人身心影响最大，是骨科的多发和常见病，相比较骨科其它疾病其致残率很高。

富白细胞-富血小板纤维蛋白 (Leukocyte-and platelet-rich fibrin，L-PRF)凝胶是自体富血小板与白细胞第二代纤维生物浓缩制品。L-PRF凝胶制备过程没有添加任何外源性物，可以避免三种(免疫排斥、交叉感染、凝血功能障碍)风险出现，因为L-PRF纤维蛋白具有网状结构，所以其含有细胞因子释放持久更好满足临床需求，L-PRF与生物体生理状态相似，使用中具有极高安全性，临床方面具有广阔的应用前景。

骨髓间充质干细胞(Bone Mesenchymal Stem Cells，BMSCs)生物体中骨髓含量极少，主要存在生物体①器官间质和结缔组织，数量与年龄增加呈反比。其培养方法简便，另外体外增殖迅速，因为BMSCs可以进行冷冻保存，所以现在细胞及基因治疗中已成为种子细胞，临床方面具有广阔的应用价值[16]。

实验研究L-PRF凝胶联合BMSCs对ANFH兔各组移植处理28d、56d，D组：空缺骨陷窝百分比明显低于A 、B和C组3组，差异有统计学意义(P<0.05)。

实验研究L-PRF凝胶联合BMSCs对ANFH兔各组移植处理28d、56d，股骨头坏死区新生血管计数统计情况如下：移植处理28d、56d，C、D组：股骨头坏死区新生血管数明显高于A、B组，B组：股骨头坏死区新生血管数多于A 组，D组：股骨头坏死区新生血管数明显高于C组，各组相比较差异有统计学意义(P<0.05)。

实验研究L-PRF凝胶联合BMSCs对ANFH兔各组移植处理28d、56d，股骨头骨密度测量统计情况如下：移植处理28d、56d，B 组与A 组和D组与C组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

实验结果证实L-PRF凝胶结合BMSCs对ANFH兔骨陷窝与血管和骨密度影响实验研究，B：L-PRF组，髓芯减压结合50μg L-PRF凝胶移植同时进行；C：BMSCs组，髓芯减压结合50μL 1×106/mL BMSCS细胞液移植同时进行；D：L-PRF+ BMSCs联合组，髓芯减压结合50μg L-PRF凝胶+50μL 1×106/mL BMSCS细胞液移植同时进行均有效果，其中以L-PRF+ BMSCs联合效果最佳。