辣椒苗期耐低温弱光鉴定指标研究

王春萍 张世才 杨小苗 蒋晓英 李怡斐 黄启中 黄任中 林 清

(1重庆市农业科学院生物技术研究中心，逆境农业研究重庆市市级重点实验室，重庆 401329；2重庆市农业科学院蔬菜花卉研究所，重庆 401329)

辣椒(Capsicum annumL.)喜温，正常生长温度为20～30℃，最适生长温度为24～28℃，低于15℃生长发育受阻，持续低于12℃植株可能受低温伤害，低于5℃植株受低温伤害严重或死亡[1-2]；辣椒又是中光性作物，光照不足会导致植株徒长，花蕾发育不良，易出现落花落果现象[3]。低温弱光天气对于我国北方设施栽培辣椒十分不利，南方早春的倒春寒天气也可能给辣椒生产带来严重损失。加强耐低温弱光辣椒资源评价、培育耐低温弱光品种是抵御低温弱光逆境的最理想途径，而确立准确高效的耐低温弱光鉴定方法是实现该径的前提条件之一。

辣椒耐低温鉴定方法研究起步较早，已取得较多研究进展[4-7]。辣椒耐低温弱光鉴定方法研究起步较晚，也取得了一些进展，如刘雪梅[8]和朱晨曦[9]利用相对株高、相对茎粗、相对叶长和相对叶宽等生长指标对辣椒进行了耐低温弱光性鉴定，颉建明等[10-12]和王春萍等[13]研究了渗透物质、类胡萝卜含量以及叶绿素荧光参数与辣椒耐低温弱光性的关系。这些研究为辣椒耐低温弱光鉴定提供了重要参考，但目前辣椒耐低温弱光鉴定方法仍缺少一套高效统一的鉴定指标，要建立更加准确可靠的方法还需要将生长指标和生理指标相结合，进行更加综合系统的研究。

本研究以5 份耐低温弱光特性不同的辣椒为材料，研究了低温弱光处理后辣椒幼苗的冷害指数、SPAD 值、叶绿素荧光参数和根系形态等指标变化，并分析了恢复生长28 d 后这些指标以及干物质量积累的恢复情况，从中筛选最适宜的辣椒苗期耐低温弱光鉴定指标，旨在优化辣椒耐低温弱光鉴定指标，为确立准确高效的辣椒耐低温弱光鉴定方法提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为茄门甜椒、南京早椒、US12、US20 和US21 等5 份辣椒材料，其中茄门甜椒低温敏感，南京早椒耐低温，由重庆市农业科学院蔬菜花卉研究所辣椒研究室提供，US12、US20 和US21 是由美国新墨西哥州立大学引进的自交系材料，耐低温特性未知。

1.2 试验设计

1.2.1 低温弱光处理 选取籽粒饱满的辣椒种子于55℃蒸馏水中浸泡15 min，再用蒸馏水冲洗3 次，然后于25℃蒸馏水浸泡1～2 h。将种子平放于铺有2 层湿润滤纸的培养皿中，25℃黑暗培养至萌发。待胚芽长至0.5 cm 左右，播种于漂浮板上，利用营养液水培[14]，昼/夜温度28℃/25℃，光照300 μmol·m-2·s-1，光周期12 h/12 h。长至四叶一心时，选择长势较为整齐的辣椒幼苗为试验材料，试验设对照组和低温弱光组，对照组植株在昼/夜温度28℃/25℃(昼/夜)，光照300 μmol·m-2·s-1，光周期12 h/12 h 条件下生长，每种材料设3 个重复，每个重复10 棵植株。低温弱光组植株在昼/夜温度10℃/5℃，光照100 μmol·m-2·s-1，光周期12 h/12 h 条件下生长，每种材料设3 个重复，每个重复10 棵植株，处理5 d 后进行冷害指数统计[7]，并与对照组植株一起进行叶片SPAD 值、根系形态和叶绿素荧光参数测定。

1.2.2 恢复生长处理 将1.2.1 中低温处理5 d 后的材料转入与对照组植株相同的条件下生长，28 d 后和对照组植株一起进行SPAD 值、叶绿素荧光参数、根系形态、茎叶干重和根系干重测定，并计算根冠比。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 冷害指数测定 根据植株受低温弱光伤害程度将其分为5 个冷害等级:

0 级:无明显症状；

1 级:植株第1、第2 叶叶缘失水，其他无明显冷害症状；

2 级:植株第1、第2 叶叶缘失水严重，第3 叶叶缘略失水，心叶无明显冷害症状；

3 级:植株第1、第2 叶叶缘出现脱水斑，第3 叶叶缘严重失水，心叶略失水；

4 级:植株第1、第2 叶脱水斑连接成片，叶片萎蔫，第3 叶出现脱水斑，心叶严重失水；

5 级:全部叶片萎焉，幼苗在常温下不能恢复。

冷害指数=Σ(各级株数×级数)/(总株数×最高级别数)。

1.3.2 叶片SPAD 值和根系形态测定 采用SPAD-502 Plus 便携式叶绿素测定仪(柯尼卡美能达，日本)测定每棵植株功能叶的SPAD 值，然后取平均值；利用Epson Perfection V850 pro 根系扫描仪(爱普生，北京)和WinRHIZO 根系分析系统(Regent 公司，加拿大)对根系的长度、表面积、直径、体积和根尖数等形态参数进行测定分析。

1.3.3 叶绿素荧光参数测定 每个重复随机选取3棵植株，每棵植株选第一片完全展开的功能叶测定光合系统Ⅱ(PhotosystemⅡ，PSⅡ)最大光化学量子产量(maximum photochemical，Fv/Fm)、光化学淬灭系数(photochemical quenching，qP)、非光合学淬灭系数(Non-photochemical quenching，NPQ)和相对电子传递速率(relative electron transport rate，ETR)等叶绿素荧光参数，参照王春萍等[13]的方法测定。

1.3.4 干重测定 将地上部分(茎叶)和地下部分(根系)分别于105℃杀青30 min，然后于70℃烘干至恒重后称其干重。

1.4 数据分析

采用Excel 2007 和SPSS 19.0 进行数据分析。隶属函数计算公式:当测定指标值与耐低温弱光性呈正相关时，Pij=(Xij-Xjmin)/(Xjmax-Xjmin)，当测定指标与耐低温弱光性呈负相关时，Pij=1-(Xij-Xjmin)/(Xjmax-Xjmin)，Xij为第i个材料第j个指标的低温弱光处理组植株的测定值与对照组植株测定值的比值；Xjmin为第j个指标的比值最小值；Xjmax为第j个指标比值的最大值。各材料各指标隶属函数值进行累加后得到的平均值即为平均隶属度，用于综合评价辣椒材料的耐低温弱光能力，平均隶属度越高则材料耐低温弱光性越强[15]。

2 结果与分析

2.1 辣椒幼苗受冷害程度鉴定

冷害指数可以从形态上初步反映材料受低温弱光伤害的程度。由图1可知，5 份材料受10℃/5℃(昼/夜)，100 μmol·m-2·s-1低温弱光伤害程度由大到小依次为:茄门甜椒＞US20＞US21＞US12＞南京早椒，茄门甜椒受低温弱光伤害最大，南京早椒受低温弱光伤害最小，US21 和US20 受低温弱光伤害程度接近。

2.2 低温弱光对辣椒幼苗SPAD 值的影响

由图2可知，低温弱光处理5 d 后，仅有南京早椒的SPAD 值受低温弱光处理影响不显著，其余4 份材料在低温弱光处理5 d 后SPAD 值均显著下降。恢复生长28 d 后，除US20 和茄门甜椒外，其余3 份材料的SPAD 值均恢复到了正常水平，推断US20 和茄门甜椒这两份材料受低温弱光伤害较大，恢复能力较其余3份材料小，这与冷害指数结果一致，说明SPAD 值对于检测辣椒叶片受低温弱光伤害程度比较灵敏。

2.3 低温弱光对辣椒幼苗叶绿素荧光参数的影响

由图3可知，与对照组植株相比，低温弱光处理5 d 后5份材料的Fv/Fm均显著降低，南京早椒下降幅度最小，茄门甜椒下降幅度最大，其余3 份材料下降幅度接近；NPQ 在5 份材料中均未发生显著变化；茄门甜椒、南京早椒和US20 的qP 下降，但只有南京早椒达到了差异显著水平；南京早椒、US20 和茄门甜椒的ETR 显著降低，而US21 和US12 的ETR 未发生显著变化。因此，低温弱光处理后Fv/Fm与低温冷害指数调查结果相关性较高，NPQ、qP 和ETR 与冷害指数调查结果存在差异。

恢复生长28 d 后，各辣椒材料的Fv/Fm、NPQ、qP和ETR 均恢复到正常生长水平(图4)，说明无论是耐低温弱光材料还是低温弱光敏感材料均可恢复低温弱光对其PSⅡ的伤害。

2.4 低温弱光对辣椒幼苗根系形态的影响

对辣椒根系长度、根系表面积、根系直径、根系体积和根尖数进行分析，结果如表1所示。与对照组相比，低温弱光处理5 d 后茄门甜椒、南京早椒和US20的根系长度均显著降低，US21 和US12 未发生显著变化；除南京早椒外，US21、US20、US12 和茄门甜椒根系直径显著降低；南京早椒、US20、US12 和茄门甜椒的根系体积和根尖数均显著降低；南京早椒和US21 的根系表面积有所增加，但差异未达到显著水平，其余3份材料的根系表面积减小，差异也未达到显著水平。综合分析表明，根系直径变化与冷害指数调查结果相关性较高，而其余根系形态指标与冷害指数调查结果存在差异。恢复生长后，US21、US20、US12 和茄门甜椒的根系直径未恢复到正常水平(表2)，说明低温弱光对辣椒幼苗根系直径造成的伤害难以恢复。因此，低温弱光处理5 d 后根系直径对于检测辣椒苗期耐低温弱光具有较高的灵敏性。

2.5 恢复生长后干物质积累特点

恢复生长后辣椒幼苗的茎叶干重、根系干重、整株干重和根冠比如表3所示，仅茄门甜椒的茎叶干重、整株干重和根冠比与对照组差异显著，说明茄门甜椒受低温弱光伤害最严重，与前文低温弱光处理5 d 后通过冷害指数、SPAD 值、Fv/Fm以及根系直径等4 个指标检测到的受低温弱光影响程度一致，同时也说明恢复生长后辣椒幼苗的茎叶干重、根系干重、整株干重和根冠比等4 个指标对辣椒苗期耐低温弱光鉴定具有参考价值。

表1 低温弱光处理5 d 对辣椒幼苗根系形态的影响Table 1 Effect of five days chilling and weak light treatment on the root morphology of the pepper seedlings

表2 恢复生长28 d 后辣椒幼苗的根系形态特征Table 2 Morphological characteristics of root system of the pepper seedlings after twenty-eight days restore growth

2.6 不同辣椒材料苗期耐低温弱光综合评价

综上可知，低温弱光处理5 d 后的SPAD 值、Fv/Fm和根系直径，以及恢复生长28 d 后的茎叶干重、根系干重、整株干重和根冠比等7 个指标能够灵敏地反映辣椒耐低温弱光性，因此，以这些指标低温弱光组植株测定值与对照组植株测定值的比值为变量计算各指标的隶属函数值，并利用隶属函数值的平均值综合评价各辣椒材料的耐低温弱光特性。结果表明，5 份材料的耐低温弱光性从强到弱依次为:南京早椒＞US12＞US21＞SU20＞茄门甜椒(表4)，与利用冷害指数鉴定的结果一致，说明本研究筛选出的7个耐低温弱光相关指标可用于辣椒耐低温弱光的综合评价。

表3 恢复生长28 d 辣椒幼苗干物质积累Table 3 Dry matter accumulation of the pepper seedlings after twenty-eight days restore growth

表4 辣椒耐低温弱光相关指标隶属函数值Table 4 Membership function value of tolerance related indexes of low temperature and weak light in pepper

3 讨论

叶绿素是植物进行光合作用的主要色素，在光合作用的光吸收过程中起核心作用，其含量直接影响植物光合能力的强弱。曹克友等[16]研究表明，低温弱光处理10 d 后辣椒功能叶片总叶绿素含量、叶绿素a 和叶绿素b 含量均呈下降趋势。王萍等[17]研究表明，在亚适温弱光(100 μmol·m-2·s-1，23℃/10℃)条件下，辣椒叶片的叶绿素含量增加，随着温度和光照强度的降低，叶绿素含量逐渐降低。因此，低温弱光胁迫下叶绿素含量的变化可以灵敏地指示辣椒对低温弱光胁迫的响应。SPAD 值与叶绿素含量呈显著正相关[18]，本研究表明，低温弱光处理后耐性辣椒材料的SPAD 值下降幅度小于非耐性材料，并且在恢复生长后耐性材料的SPAD 值能恢复到正常水平，而非耐性材料的SPAD 值未恢复到正常水平，说明在本研究设定的低温弱光条件下测出的SPAD 值具有较高的灵敏性。

叶绿素荧光是叶绿素分子吸收光子后分子能级发生变化，由基态变为激发态后再回到基态时释放出的光子。叶绿素荧光参数作为实时监测植物PSⅡ的探针十分灵敏[12，19-21]。前期研究表明，10℃/5℃，70 μmol·m-2·s-1低温弱光处理1 d 后，非耐低温弱光性辣椒材料的Fv/Fm略有下降，耐性材料Fv/Fm略有上升，但均未达到显著水平，而处理5 d 后耐性材料和非耐性材料的Fv/Fm均显著降低，且耐性材料下降幅度小于非耐性材料[13]。本研究结果与前期结果相同，再一次证明低温弱光处理5 d 的Fv/Fm在鉴定辣椒耐低温弱光时具有灵敏性和稳定性。qP 的下降表明PSⅡ的原初光化学反应通过下调光合电子传递来匹配碳代谢对ATP 和NADPH 需求的减少[22]，NPQ 上升反映了PSⅡ天线色素吸收的光能以热耗散形式耗散掉的部分增加[23]，这是植物在低温弱光下的自我防御机制。颉建明等[12]研究了低温弱光(15℃/5℃，100 μmol·m-2·s-1) 处理5、10、15 和20 d 后辣椒叶片的叶绿素荧光参数变化，发现处理15 d 后多数辣椒材料的叶片qP 显著下降，仅有少部分材料的NPQ 显著增加。本研究前期表明在10℃/5℃，70 μmol·m-2·s-1低温弱光条件下，qP 随处理时间的延长呈降低趋势，NPQ 在处理3 d 和5 d 后显著上升，处理7 d 后非耐性品种NPQ 显著下降，耐性品种NPQ 显著上升或无显著变化[13]。本研究表明，10℃/5℃，100 μmol·m-2·s-1低温弱光处理5 d 后5 份材料的qP 变化趋势不一致，且NPQ 在5 份材料中均未发生显著变化，推测不同低温弱光处理强度下辣椒材料启动自我防御机制的时期存在差异，在本研究的处理强度下未能体现qP 和NPQ与材料耐低温弱光性的相关性。

根系是植物吸收营养和水分的重要器官，其发育状况与植株的生长息息相关[24-25]。植物的根系形态特征是由自身遗传特性和所处环境共同作用的结果[26-27]，根系长度、根系表面积和根系直径等形态指标是描述根系吸收能力的重要参数，不仅能同级反映植物生长发育情况，也可衡量植物的抗逆性[28]。任旭琴等[29]研究了低温逆境下辣椒根系总长度、根系直径和根系体积等根系形态变化，发现随着温度的降低，根系总长度呈下降趋势。已有研究表明低温弱光对辣椒幼苗的根系干重和鲜重均有影响[30-31]，而对于低温弱光下辣椒根系的形态变化尚鲜见报道。本研究对低温弱光处理后辣椒的根系形态进行了分析，并对其恢复生长后的情况进行了跟踪调查，结果显示，低温弱光对辣椒根系的生长具有明显抑制作用，具体表现在低温弱光处理后辣椒的根系长度、根系表面积、根系直径、根系体积和根尖数降低；不同耐性材料对低温弱光的响应存在差异，其根系直径对于反映辣椒耐低温弱光性具有较高的灵敏性。这些结果进一步完善了辣椒耐低温弱光的研究数据。

4 结论

研究表明，采用水培法，以四叶一心期辣椒幼苗为材料，10℃/5℃(昼/夜)，100 μmol·m-2·s-1低温弱光处理5 d 的SPAD 值、Fv/Fm和根系直径，以及恢复生长28 d 后的茎叶干重、根系干重、整株干重和根冠比等7 个指标对于检测辣椒耐低温弱光具有较高灵敏性和稳定性，可作为辣椒苗期耐低温弱光鉴定指标，为辣椒耐低温弱光鉴定体系的优化提供参考。