小麦背景中披碱草部分染色体的FISH鉴定

宫文萍 汪晓璐 韩 冉 李光蓉 李豪圣 刘建军 刘 成 杨足君

(1山东省农业科学院作物研究所/农业农村部黄淮北部小麦生物学与遗传育种重点实验室/小麦玉米国家工程实验室，山东 济南 250100；2电子科技大学生命科学与技术学院，四川 成都 610054)

小麦(Triticum aestivumL.)是世界上重要的粮食作物之一，但白粉病和锈病等病害严重影响小麦生产[1-2]。小麦近缘物种中含有丰富的抗病基因，是小麦育种的优异基因源。将小麦近缘物种含有的抗病基因导入小麦，是改良栽培小麦抗性的有效方法[2]。披碱草属是Carl Linne 于1753年建立的一个老属，含有83 个种、20 个变种和一些称为变型的分类群，共含约150 种多年生植物[3-4]，广泛分布于欧洲、亚洲、南北美洲、澳洲和新西兰等温带、热带、亚热带以及北极地区[5]，是小麦族中最大、分布最广的属。粗穗披碱草[原名纤毛鹅观草(Roegneria ciliaris)，科学家也称其为Elymus trachycaulus，基因组StStHtHt，2n=4x=28]和纤毛披碱草(Elymus ciliaris，基因组ScScYcYc，2n=4x=28)是披碱草属的两个种，分别于1966 和1968年被研究者发现[6-7]。

粗穗披碱草高抗小麦条锈病[8]、叶锈病[8-11]、秆锈病[8，12]、白粉病[8-10]、大麦黄矮病[8-12]和梭条花叶病[8，10，12]等病害，可用于土壤生态改良[13]，并作为基因资源改良大麦[14]。在小麦与粗穗披碱草远缘杂交研究方面，Smith 早在1942年就开始了将该种质向小麦导入的工作[15]，但是之后的报道称导入未获得成功[16]。其后，Sharma[17]利用胚拯救技术开展了将粗穗披碱草导入小麦的工作，获得了一批杂交后代材料。Morris 等[12]、Gill 等[8]和Jiang 等[18]分别从这批杂交后代材料中筛选并鉴定出了小麦-粗穗披碱草染色体附加系、代换系、易位系和端体系等材料。

纤毛披碱草高抗小麦叶锈病[19]、秆锈病[19]、赤霉病[20]、小麦条纹花叶病[19]和大麦黄矮病[19，22]等病害。在小麦与纤毛披碱草远缘杂交研究方面，刘大均院士课题组于19世纪80年代开展了该种质向小麦导入工作[20]。其后，多个研究团队先后从小麦-纤毛披碱草交后代材料中筛选并鉴定出了小麦-纤毛披碱草染色体附加系或易位系等材料，并且其中部分材料的赤霉病或黄矮病抗性良好[21-26]。

虽然小麦-粗穗披碱草[8，11，17-18]和小麦-纤毛披碱草[20-26]种质已经被创制出来，然而，已建立的能够快速鉴定小麦背景中粗穗披碱草和纤毛披碱草的分子和细胞学方法还非常有限。以寡聚核苷酸OligopSc119.2-1 和Oligo-pTa-535-1 为探针的双色荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)结合以寡聚核苷酸(GAA)8为探针的单色FISH，既可以有效快速鉴定小麦染色体[27]，又可以鉴定小麦背景中的单芒山羊草[28]、顶芒山羊草[29]和无芒山羊草[30]等物种染色体。然而，上述3 个探针结合鉴定小麦背景中粗穗披碱草或纤毛披碱草染色体的报道尚鲜见。本研究用上述3 个探针顺序FISH 对小麦-粗穗披碱草附加系和小麦-纤毛披碱草附加系进行分析，拟建立能用于鉴定小麦2 种披碱草染色体的标准核型，提供检测小麦2 种披碱草染色体的细胞学方法，为鉴定小麦染色体的结构变异奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试材料均由美国堪萨斯州大学小麦遗传资源中心的Bernd Friebe 教授惠赠(表1)。

1.2 试验方法

1.2.1 根尖采集 将供试材料种子放于铺有打湿滤纸的培养皿中，置于22～24℃的恒温光照培养箱中，培养约24 h。待种子萌动后，将培养皿转到4℃冰箱处理24 h。然后，转入22～24℃恒温光照箱培养24～35 h，待根尖长至1～1.5 cm 时采集根尖，冰水混合物处理24 h，卡诺固定液Ⅰ(无水乙醇∶冰醋酸=3∶1)固定3～7 d，放入4℃冰箱备用。

1.2.2 根尖处理与染色体制片 将备用根尖的分生组织切下，放入含2%果胶酶R-10(日本Yakult 公司)和2%纤维素酶Y-23(日本Yakult 公司)的10 μL 混合酶液中，37℃水浴50 min 酶解。酶解后，用70%酒精冲洗2 次，用解剖针将根尖分生组织捣碎，低速(2 000 r·min1) 离心10 s，倒掉酒精，加入100%乙酸20 μL，涡旋混匀；取7 μL 根尖分生组织细胞悬浮液，滴到载玻片上，约5 min 待乙酸完全挥发后镜检，镜检合格的染色体制片置于-20℃冰柜中备用。

表1 供试材料Table 1 The materials used in the research

1.2.3 荧光原位杂交 取浓度约为10 μmol·L-1的探针0.2 μL(双色FISH 两探针各加0.2 μL)加入到8 μL 2×柠檬酸钠盐(saline sodium citrate SSC)(pH 值7)溶液中，涡旋混匀配成杂交液。将杂交液滴至制备好的玻片上，盖上盖玻片，置于湿润的塑料盒中80℃变性5 min，然后将塑料盒置于37℃杂交箱中，杂交5 h。取出染色体制片，放于2×SSC 溶液的洗脱缸中，洗掉盖玻片和杂交液，然后再用ddH2O 冲洗一遍，晾干，避光滴加一滴抗褪色剂(propidium iodide，PI)，盖上盖玻片用OLYMPUS BX53 荧光显微镜[奥林巴斯(中国)有限公司]镜检，DP70CCD 镜头下拍照。

杂交过一次的染色体制片进行二次FISH 前，需用95%的乙醇泡玻片5～10 min，将FISH 信号洗脱掉，然后再用卡诺固定液Ⅰ固定1 h，晾干后可再次FISH。试验所用探针Oligo-pSc119.2-1、Oligo-pTa-535-1 和(GAA)8序列参见文献[27-28]，由成都瑞信生物公司合成。

2 结果与分析

2.1 小麦-粗穗披碱草附加系FISH 分析

利用探针Oligo-pSc119.2-1 和Oligo-pTa-535-1对中国春-粗穗披碱草1St附加系、5Ht附加系、6Ht附加系和7Ht附加系进行FISH 分析，然后洗掉探针杂交信号，再利用探针(GAA)8进行顺序FISH，结果发现，上述探针结合使用可以有效鉴别全部小麦染色体和外源染色体(图1-A、C、E)，其中，5Ht附加系FISH 图如图1-A 和1-B 所示，其2n=44，1 对粗穗披碱草5Ht染色体的着丝粒区、短臂中部和末端、长臂端部和亚端部覆盖有很强的Oligo-pTa535-1 信号，整条染染色体无Oligo-pSc119.2-1 信号(图1-A、图2)。此外，该染色体长臂近着丝粒处有较强的(GAA)8信号(图1-B、图2)。另外发现一条2B 染色体的短臂末端易位到4A 短臂上，形成2BS-4AS·4AL 易位染色体，该条短臂末端发生结构变异的2B 染色体标记为2B-del(图1-A、图3)，而另一条2B 和4A 为完整染色体(图1-A)，未发生染色体重排。

顺序FISH 对中国春-粗穗披碱草1St附加系分析发现，该附加系自交后自发变成了中国春-粗穗披碱草染色体代换系(2n=42)，其中小麦1BL 和3BS 染色体臂发生重组形成一对3BS·1BL 易位系(图3)，而染色体臂3BL 和1BS 丢失，因此，该材料是中国春-粗穗披碱草1St(1BS·3BL)代换系。Oligo-pTa-535-1 杂交信号仅分布于1St短臂近端部和近着丝粒区域，而1St长臂上没有双色FISH 信号(图2-A)。(GAA)8在1St染色体着丝粒处、短臂近着丝粒处有很强的杂交信号，在长臂近着丝粒处有弱(GAA)8信号(图2-B)。同时，相比对照中国春，该材料有一对5A 染色体短臂端部Oligo-pSc119.2-1 信号丢失(图3)，即OligopSc119.2-1 序列发生了删除，该染色体记为5A-del。

顺序FISH 对中国春-粗穗披碱草6Ht附加系分析显示，其2n=44，一对6Ht染色体在除了长臂端部和近着丝粒区外的位置几乎全被Oligo-pTa-535-1 信号覆盖；短臂亚端部和短臂中部有Oligo-pSc119.2-1 信号(图2-A)。6Ht染色体短臂亚端部、长臂近着丝粒区和长臂中部具有较强(GAA)8信号(图2-B)。该附加系中的小麦染色体Oligo-pSc119.2-1、Oligo-pTa-535-1 和(GAA)8杂交信号与中国春相同，未发现小麦染色体结构变异情况。

顺序FISH 对中国春-粗穗披碱草7Ht附加系分析显示，其2n=44，一对7Ht染色体短臂末端具有较强的Oligo-pSc119.2-1 信号，其短臂亚端部和短臂中部、长臂近着丝粒区、长臂亚端部和端部均有Oligo-pTa-535-1 信号，信号几乎完全覆盖整条染色体(图2-A)。7Ht染色体短臂近末端、短臂中部、短臂和长臂近着丝粒区、长臂中部均有较强(GAA)8信号(图2-B)。该附加系中的小麦染色体Oligo-pSc119.2-1、Oligo-pTa-535-1 和(GAA)8杂交信号与中国春相同，未发现小麦染色体结构变异情况。

2.2 小麦-纤毛披碱草附加系FISH 分析

顺序FISH 对小麦-纤毛披碱草1Sc附加系、3Sc附加系、1Yc附加系、5Yc附加系和7Yc附加系进行分析发现，除3Sc附加系2n=42＋2t(t=telosomics，端体)外，其余4 份附加系2n=44；与中国春相比，5 份附加系中的小麦染色体均未见染色体结构变异情况，外源染色体的FISH 信号较少且信号强度较弱(图1-C～F，图2)。其中，1Sc短臂末端具有微弱的Oligo-pSc119.2-1 杂交信号(图2-A)，短臂近着丝粒处有微弱的(GAA)8杂交信号(图2-B)。3Sc附加系中发现1 对端体，没有任何杂交信号(图2)，因该附加系的42 条小麦染色体是完整的，所以这对端体应该是3Sc染色体长臂或短臂。1Yc染色体短臂末端和着丝粒处具有微弱的Oligo-pSc119.2-1 信号(图1-C、图2-A)，着丝粒处具有较弱的(GAA)8杂交信号(图1-D、图-2B)。5Yc染色体短臂近着丝粒处具有Oligo-pSc119.2-1 信号(图1-E、图2-A)，长臂近着丝粒处具有弱(GAA)8信号(图1-F、图2-B)。7Yc染色体短臂末端具有较强的Oligo-pSc119.2-1 信号、长臂末端具有弱OligopSc119.2-1 信号，其短臂和长臂近末端以及着丝粒处具有弱Oligo-pTa-535-1 信号(图2-A)，着丝粒处即短臂近着丝粒处具有微弱的(GAA)8信号(图2-B)。

3 讨论

物种染色体特异标记是鉴定小麦远缘杂交种质的重要工具。在粗穗披碱草和纤毛披碱草染色体特异标记建立方面，Morris 等[31]建立了染色体标准C 带和N带；Gill 等[8]建立了染色体特异限制性内切酶片长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)标记；Jiang 等[18-19]建立了生化标记并获得了检测粗穗披碱草St基因组的特异探针。此外，Kay 等[32]建立了粗穗披碱草蛋白质标记和形态学标记；宫文萍等[9]建立了粗穗披碱草1Ht染色体特异酶切扩增多态性序列(cleaved amplified polymorphic sequence，CAPS)标记。陶文静等[23]建立了纤毛披碱草染色体特异RFLP 标记；孔令娜等[25]建立了纤毛披碱草染色体1、2 和6 同源群分子标记；韩冉等[33]建立了粗穗披碱草1Yc染色体特异PLUG 标记。然而，N 带、C 带、RFLP 标记操作费时费力，单个生化标记或分子标记仅能对小麦中单条披碱草染色体进行检测。本研究利用寡聚核苷酸为探针，建立了粗穗披碱草部分染色体标准FISH 核型，为小麦背景中粗穗披碱草1St、5Ht、6Ht和7Ht染色体鉴定跟踪提供了新的检测方法。然而，纤毛披碱草FISH 信号太弱，较难用于小麦-纤毛披碱草染色体重组体的鉴定，在今后的研究中应加强其染色体特异分子标记的开发与利用。

包括双二倍体/部分双二倍体、附加系和代换系等在内的小麦-远缘物种染色体系的鉴定保存是小麦种质资源学的重要研究内容之一[10，30，33-34]。由于种质资源数量多或鉴定条件限制，研究种质资源的人员对这些材料的繁殖往往通过种植-扬花前套袋-自交-收种保存等步骤进行。然而，本研究前期在利用FISH 对小麦-单芒山羊草1N～7N 附加系进行检测时发现，4N附加系部分单株自发形成了4N(4B)易位系[34]；对小麦-希尔斯山羊草1Ss～7Ss附加系进行FISH 检测时，发现1Ss附加系和4Ss附加系部分单株自发形成了1Ss(1B)代换系和4Ss(1D)代换系(结果未发表)。Garg 等[35]发现小麦-长穗偃麦草1E 附加系可自发形成1E(1D)代换系。本研究发现小麦-粗穗披碱草1St附加系已经自发形成了1St(1BS·3BL)代换系。上述现象表明，部分小麦-远缘物种附加系细胞学并不稳定，因此，繁种前后应对材料进行单株细胞学鉴定。上述现象不能简单解释为小麦花粉污染造成，因为附加系提供配子是21′＋1′，飞花小麦提供配子为21′，其杂交后代只能有21″、21″＋1′或21″＋1″三种情况，无法自然产生20″＋1″即代换系。因此，附加系自发形成代换系的机制，以及形成代换系的染色体偏好性等问题都还有待进一步研究。

染色体重排是物种进化的重要动力[35]，这种重排可能是染色体缺失、易位、环染色体、双着丝粒染色体和臂间内倒位等[36-38]。在小麦族中，染色体重排现象并非个例。目前，已有研究报道在一粒小麦[39]、乌拉尔图小麦[40]、粗穗披碱草[18-19]、冰草[41]、单芒山羊草[28]、小伞山羊草[42]、偏凸山羊草[43]、顶芒山羊草[44]、尾状山羊草[45]、簇毛麦[46]和黑麦[47]等物种中均发现了染色体重排现象。本研究在小麦-披碱草附加系/代换系中不仅发现3BS·1BL 和2BS-4AS·4AL易位(图3)，还发现了染色体3BL 和1BS 丢失、2BS 和5AS 端部丢失(图3)等现象。这些染色体结构变异，可以解释为物种适应环境或为达到细胞学稳定性最佳状态的自我调节，然而，这种染色体重排造成的基因顺序重排、基因邻接的功能、重排后基因转录表达水平等问题仍有待进一步深入研究。

4 结论

本研究利用寡聚核苷酸Oligo-pSc119.2-1 和Oligo-pTa-535-1 为探针的双色FISH 和以(GAA)8为探针的单色FISH 建立了粗穗披碱草1St、5Ht、6Ht、7Ht染色体标准FISH 核型，确定了检测小麦背景中粗穗披碱草染色体的跟踪鉴定方法，获得了小麦-粗穗披碱草1St(1BS·3BL)代换系及5A-del 和2BS-4AS·4AL 等染色体结构变异体，为研究染色体结构变异与表型关联分析提供了研究基础。然而，纤毛披碱草FISH 信号太弱，需在今后的研究中加强其基因组特异FISH 新探针及其染色体特异分子标记的开发。