磷酸氯喹片微生物限度检查方法适用性研究

李文靖，张帆，凌晓敏

广东省药品检验所，广东 广州 510000

氯喹是一种4-氨基喹啉类衍生物，在1934 年由汉斯.安德萨格（Hans.Andersag）发明［1］，随后开始广泛应用于疟疾、炎症和病毒感染性疾病［2］。磷酸氯喹是氯喹的磷酸盐，有着70 年抗疟历史，但随着近年来医疗卫生条件的改善，疟疾在中国已基本被消灭，国内许多药企已很少生产该药，甚至停产［3］，新冠肺炎发生后，专家组发现磷酸氯喹对新冠肺炎患者能起到有效治疗，能降低重症患者病亡率，阻止轻症向重症发展，随后纳入新冠肺炎治疗方案（试行第六版）［4］。磷酸氯喹通过干扰核内体酸化抑制病毒入侵而起到抗病毒的作用［5］，临床应用发现其治疗新冠肺炎病毒不良反应较轻［6-7］，并且加速普通新型冠状病毒肺炎患者核酸转阴时间较为显著［8］。药企迅速复产磷酸氯喹的片剂，争取在最短时间内通过检测投入临床使用，但由于停产的时间较长，该药的微生物限度检查方法并未及时更新，现根据2015 版《中国药典》四部［9］非无菌产品微生物限度检查方法，建立磷酸氯喹片的微生物检查方法，对4个厂家7批产品进行方法适用性试验，结果表明方法准确、可靠。

1 实验材料

1.1 样品

磷酸氯喹片，A 厂家批号：200201、200205、200216；B 厂家批号：T00001、T00005；C 厂家批号：20 200214；D 厂家批号：KH06710A，规格均为0.25 g；A、B、C 为国内药企，D 为国外药企。

1.2 仪器

BSA2202S 电子天平（SARTORIUS，百分之一），JY-A 匀浆仪（台州椒江五星试压），Lab dancer混合器（IKA），1379 型生物安全柜（Thermo），MIR-254-PC 型生化培养箱（松下），CD-B33 型水浴箱（Julabo）。

1.3 培养基

胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA，批号：1806062），沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA，批号：1905062），胰酪大豆胨液体培养基（TSB，批号：1083591），沙氏葡萄糖液体培养基（SDB，批号：1080971），麦康凯液体培养基（批号：1075425），麦康凯琼脂培养基（MAC，批号：1069751），以上培养基适用性检查结果均符合《中国药典》2015 版规定。

1.4 菌种

大肠埃希菌（Escherichia coli）［CMCC（B）44102］、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）［CMCC（B）26003］、铜 绿 假 单 胞 菌（Pseudomonas aeruginosa）［CMCC（B）10104］、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）［CMCC（B）63501］、白色念珠菌（Candida albicans）［CMCC（F）98001］、黑曲霉（Aspergillus niger）［CMCC（F）98003］，均来源于中国食品药品检定研究院。

2 方法与结果

2.1 菌液制备

按照《中国药典》2015 版四部要求，取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉孢子新鲜培养物，分别用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1 mL 含菌量为103～104cfu 的菌悬液，作为计数用。取大肠埃希菌新鲜培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液，作为控制菌检查用。

2.2 供试液制备

取本品10 g，加pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 mL，用匀浆仪粉碎，混匀，制成1∶10的供试液，再用pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释成1∶20、1∶50 的供试液。

2.3 需氧菌总数计数方法适用性试验

2.3.1 常规平皿法试验组：取1∶10 的供试液各10 mL，分别加入2.1 项下计数用的5 种试验菌悬液0.1 mL，摇匀，取1 mL 置平皿中，注入TSA 约20 mL，混匀，待凝固后倒置培养，每个菌株平行制备2 个平皿，计数，取菌落数平均值。

菌液组：取pH 7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液各10 mL，分别加入5 种试验菌悬液0.1 mL，取1 mL 置平皿中，注入TSA 约20 mL，混匀，待凝固后倒置培养，每个菌株平行制备2 个平皿，计数，取菌落数平均值。

供试品对照组：取1∶10 的供试液，以稀释液代替菌悬液同试验组操作。

计算回收比值：各菌株回收比值=（试验组平均菌落数－供试品对照组平均菌落数）÷菌液组平均菌落数。见表1。

表1 显示，B、D 厂家3 次试验各菌株的回收均在0.5～2 范围内，需氧菌总数检查可用常规平皿法检查。而A、C 厂家用1∶10 平皿法检查，不能消除本品对铜绿假单胞菌或枯草芽孢杆菌的抑制作用，需对供试液进一步稀释后再试验。

2.3.2 稀释平皿法试验组：分别取A、C 厂家1∶20、1∶50 的供试液各10 mL，分别加入5 种试验菌悬液0.1 mL，摇匀，取1 mL 置平皿中，注入TSA 约20 mL，混匀，待凝固后倒置培养，平行制备2 个平皿，计数，取菌落数平均值。

供试液对照组及菌液组按2.3.1 项下同法操作，计算各菌株回收比值，见表2。

表1 需氧菌总数采用常规平皿法的回收比值

表2 显示，A 厂家采用1 ∶50 供试液，C 厂家采用1∶20 供试液，3 次试验各菌株的回收均在0.5～2范围内。两个厂家的需氧菌总数计数可采用供试液稀释法进行检查。

2.4 霉菌和酵母菌总数

试验组：取1∶10 的供试液各10 mL，分别加入白色念珠菌、黑曲霉孢子2 种试验菌悬液0.1 mL，摇匀，取1 mL 置平皿中，注入SDA 约20 mL，混匀，待凝固后倒置培养，每个菌株平行制备2个平皿，计数，取菌落数平均值。

菌液组：取pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液各10 mL，分别加入2 种试验菌悬液0.1 mL，取1 mL 置平皿中，注入SDA 约20 mL，混匀，待凝固后倒置培养，每个菌株平行制备2 个平皿，计数，取菌落数平均值。

供试品对照组：取1∶10 的供试液，以稀释液代替菌悬液同试验组操作。

计算回收比值：各菌株回收比值=（试验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数）/菌液组平均菌落数。结果见表3。

表2 需氧菌总数稀释法的回收比值

表3 霉菌和酵母菌总数采用平皿法的回收比值

表3 显示，4 个厂家3 次试验2 个菌株的回收比值均在0.5～2 范围内，表明本品的霉菌和酵母菌总数计数可用常规平皿法检查。

2.5 控制菌检查方法适用性试验

磷酸氯喹片为口服给药片剂，按照《中国药典》2015 版四部通则1107 要求控制菌应检查大肠埃希菌。

大肠埃希菌检查：取1∶10 供试液10 mL 及含菌量不大于100 cfu 的大肠埃希菌菌悬液，分别接种至100 mL、200 mL 胰酪大豆胨液体培养基中，依法检查。结果见表4。

表4 大肠埃希菌检查结果

表4 显示，A、B、C 三个厂家的大肠埃希菌检查需采用培养基稀释法（200 mL/瓶），D 厂家的大肠埃希菌检查采用常规法（100 mL/瓶）。

3 讨论

对4 个厂家7 批样品进行微生物方法适用性试验，结果发现：（1）B、D 两个厂家需氧菌总数采用常规平皿法时，各菌株的回收比值均在0.5～2.0 之间，说明产品在检验条件下没有抑菌性，对需氧菌总数检出的干扰可以忽略。而A、C 两个厂家采用常规平皿法时，对铜绿假单胞菌或枯草芽孢杆菌有抑菌作用，回收率达不到药典要求，需对供试液作进一步稀释，采用1∶20、或1∶50 供试液，才能去除样品对需氧菌的干扰。国内3 个厂家方法均不相同，其中一家跟国外的一致，经紫外分光光度计测定，磷酸氯喹含量均在标示量的94%～100%之间，符合标准规定，结果显示3 个厂家成品中磷酸氯喹的含量相差甚少，与造成这种差异的关系不大，可能与厂家不同的制剂工艺、原辅料来源有关，制剂工艺与辅料是影响药品制剂稳定性的因素，另外，国外有文献分析了尼日利亚7个品牌的磷酸氯喹片，发现没有一个可以说在物理和化学上是等效的［10］，说明了不同厂家的产品质量存在差异。这也是药典强调同一品种不同厂家的产品，微生物限度检查法均需做方法适用性试验的原因。（2）4 个厂家的霉菌及酵母菌计数均采用常规法，表明磷酸氯喹片对白色念珠菌和黑曲霉没有抑制作用，控制菌检查大肠埃希菌仅有D 厂家采用常规法，其余3 家厂家需采用培养基稀释法。综上所述，磷酸氯喹片需氧菌总数计数可采用常规平皿法，或需将供试液进一步稀释检查，霉菌及酵母菌总数计数用常规平皿法，检查控制菌用培养基稀释法检查。建议对本品进行微生物限度检查时，如未做方法适用性试验，需氧菌总数用1∶50 稀释液作为第一稀释级进行检查，方法准确、可靠,适用于磷酸氯喹片的微生物检查。