气相色谱串联质谱法测定二甲双胍格列本脲胶囊（Ⅱ）中N-亚硝基二甲胺的含量

程奇珍，钟振华，王鹏，曾令峰

江西省药品检验检测研究院，国家药品监督管理局中成药质量评价重点实验室，江西省药品与医疗器械质量工程技术研究中心，江西 南昌 330029

基因毒性杂质是指化合物本身能够直接或间接损伤细胞DNA，产生基因突变或体内诱变，具有致癌可能或者倾向，其特点是在较低水平时也与DNA发生作用，导致DNA 突变或者致癌［1-2］。多个细胞和动物水平的实验证明，N-亚硝胺类化合物具有强致癌作用和明显的肝毒性，不但长期小剂量接触可以致癌，而且1 次较大剂量的冲击也可以引发癌症，医学实验中也常使用N-亚硝胺类化合物对动物进行疾病造模［3-4］。

二甲双胍格列本脲胶囊（Ⅱ）是由盐酸二甲双胍250 mg 与格列本脲2.5 mg 组成的复方制剂。盐酸二甲双胍可减少肝糖原的产生，降低肠对糖的吸收，并且可通过增加外周糖的摄取和利用而提高胰岛素的敏感性；格列本脲为磺酰脲类降糖药，主要通过刺激胰岛β 细胞分泌胰岛素产生降血糖作用。两种药物联用,作用互补、较单用疗效好,特别是控制2 型糖尿病患者血糖水平的效果显著,且两者不存在配伍禁忌［5-7］。自2018 年7 月在缬沙坦原料药中检出N-亚硝基二甲胺（NDMA）以来，陆续在其他沙坦类原料药中检出了各类亚硝胺杂质，如NDMA、N-亚硝基二乙胺（NDEA）等。非沙坦类的药物中（如雷尼替丁），亦有亚硝胺类杂质的检出。2019 年12 月4 日美国食品药品监督管理局（FDA）的一份声明中表示，正在检测在美国出售的二甲双胍制剂中NDMA 的污染情况，引起了全球对二甲双胍及其相关制剂中NDMA 检测与控制的重视。NDMA 是亚硝胺类物质中极具代表性的一种，具有致癌、致畸和致突变毒性，被国际癌症研究机构（IARC）列为2A 类的遗传毒性物质［8-10］。

与传统的检测方法相比，多反应监测（MRM）模式基于已知或假定的反应离子信息，有针对性地选择数据进行质谱信号采集，对符合规则的离子进行信号记录，去除不符合规则离子信号的干扰，通过对数据的统计分析从而获取质谱定量信息的质谱技术，具有灵敏、准确和特异等优点［11-14］。为了保证二甲双胍格列本脲胶囊（Ⅱ）的安全和质量可控，实现有效的风险控制，本研究建立了二甲双胍格列本脲胶囊（Ⅱ）中NDMA 的气相色谱串联质谱（GC-MS/MS）测定方法，采用选择性更强的三重四极杆质谱仪能够提供更好的专属性，避免假阳性的结果，同时进行完整的方法学验证，保证NDMA 能够准确有效的检出。旨在为盐酸二甲双胍复方制剂中N-亚硝胺类化合物的检测研究提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器、对照品及试剂

Agilent 7890B-7000C 气相色谱-串联质谱仪；ThermoFisherSorvall ST 16R 高速离心机；

国华SHA-C 恒温震荡器；二氯甲烷，来源：美国ACS 恩科化学，批号：DC-1132-4000；N-亚硝基二甲胺（NDMA）对照品，来源：中国食品药品检定研究院，批号：510166-201902，含量：97.8%。

1.2 样品信息

本次研究共收集到A 企业生产的7 批次二甲双胍格列本脲胶囊（Ⅱ）样品（批号分别为：191104、191109、200602、200603、200604、200701、200903），规格均为每粒含盐酸二甲双胍250 mg 与格列本脲2.5 mg。

1.3 仪器条件

色谱柱：VF-WAXms（60 m×0.25 mm×0.25 μm）石英毛细管柱。测定条件：柱温：起始温度40 ℃，保持0.5 min，以10 ℃/min 升温至200 ℃，再以60℃/min 升温至240 ℃，保持10 min。进样口温度：250 ℃；恒流流速：1.0 mL/min；脉冲不分流进样，脉冲压力12.3 psi，保持0.5 min。进样体积：2 μL。EI 源温度：230 ℃；电子能量：70 eV；溶剂延迟时间：9 min。

方法学所用样品：A 企业批次样品（批号：200701）。测定NDMA 结果低于检出限（0.005 μg/g），以未检出计。离子对选择及碰撞能信息见表1。

表1 NDMA离子对选择及碰撞能

1.4 样品溶液的制备

取本品10 粒内容物细粉，精密称定，精密称取细粉适量（约相当于盐酸二甲双胍500 mg），置50 mL 离心管中，加1 mol/L 盐酸溶液10 mL，涡旋1 min，以350 次/ min 的频率振摇10 min，精密加入二氯甲烷10 mL，涡旋1 min，以350 次/ min 的频率振摇10 min，离心分离（4 000 r/ min，10 min），取下层二氯甲烷层，以0.22 μm 滤膜滤过，取续滤液。

1.5 对照品溶液的制备

精密称取NDMA 对照品99.54 mg，置100 mL预装有二氯甲烷的量瓶中，振摇使溶解，用二氯甲烷稀释至刻度，摇匀，精密量取适量，用二氯甲烷定量稀释制成含NDMA 约500 ng/mL 的溶液，作为NDMA 对照品贮备液。精密量取NDMA 对照品贮备液适量，用二氯甲烷定量稀释制成每1 mL 中分别含0.243、0.487、0.974、2.434、4.868、9.735、19.470、48.675 ng 的溶液，作为NDMA 对照品线性系列溶液。

2 方法与结果

2.1 检出限、定量限试验

取“1.5”中浓度为0.243 ng/mL 的对照品溶液作为检出限溶液，精密量取2 μL，注入气相质谱仪，其定量离子对74 →44.1 主峰的信噪比约为4.7，定性离子对74 →42.1 主峰的信噪比约为3.6；取“1.5”中浓度为0.487 ng/mL 的对照品溶液作为定量限溶液，精密量取2 μL，注入气相质谱仪，其定量离子对74 →44.1 主峰的信噪比约为11.1，定性离子对74 →42.1 主峰的信噪比约为10.6。结合样品溶液的配制比例计算得二甲双胍格列本脲胶囊（Ⅱ）中NDMA 的检出限和定量限以盐酸二甲双胍量计算分别为0.005 μg/g 及0.01 μg/g。

2.2 线性关系

按照“1.5”配制的8 个不同浓度的对照品线性系列溶液，按照“1.3”项中的仪器条件进行测定。以NDMA 的浓度（ng/mL）为横坐标，以质谱响应为纵坐标，绘制标准曲线，标准曲线测定结果：线性方程Y=100 212.420 747X-36 006.551 454，R2=0.999 7，见图1。结果表明，NDMA 在0.243～48.626 ng/mL 浓度范围内呈良好的线性关系。

图1 NDMA线性关系图

2.3 精密度试验

取“1.5”中浓度为约0.487 ng/mL 的对照品溶液重复进样6 次，所得NDMA 的峰面积分别为40 748、43 493、44 395、39 791、42 203、40 973，相对标准偏差为4.2%，结果表明，NDMA 在定量限浓度的精密度良好。取“1.5”中浓度为约2.434 ng/mL 的对照品溶液重复进样6 次，所得NDMA 的峰面积分别为218 803、224 987、209 882、219 309、230 927、220 683，相对标准偏差为3.2%，结果表明，NDMA在限度浓度的精密度良好。

2.4 稳定性试验

取5 号回收率试验溶液进行试验，分别于0、2、4、8、12、18、24 小时，注入气相质谱仪，测定峰面积，计算浓度，结果见表2。室温条件下，样品溶液中NDMA 检测量RSD 为1.5%，说明样品溶液在24 小时内较稳定。

表2 稳定性试验

2.5 回收试验

精密称取样品（批号：200701）内容物细粉适量（约相当于盐酸二甲双胍500 mg），精密称定9 份，分别置50 mL 离心管中，精密加入“1.5”中浓度为48.675 ng/mL 的对照品溶液0.25、0.25、0.25、0.5、0.5、0.5、1.0、1.0、1.0 mL，加1N 盐酸溶液10 mL，涡旋1 min，以350 次/min 的频率振摇10 min，精密加入二氯甲烷9.75、9.75、9.75、9.5、9.5、9.5、9.0、9.0、9.0 mL，涡旋混匀1 min，再以350 次/min 的频率振摇10 min，然后以4 000 rmp 的速率离心10 min，取下层二氯甲烷层，以0.22 μm 滤膜滤过，取续滤液。即得1～9 号回收率试验溶液。精密量取回收率试验样品溶液2 μL，分别注入气相-质谱仪，记录离子谱图，结果见表3。结果显示：平均回收率为96.13%，RSD 为2.4%，回收率较好。

2.6 重复性

精密称取样品（批号：200701）内容物细粉适量（约相当于盐酸二甲双胍500 mg），精密称定6份，分别置50 mL 离心管中，精密加入“1.5”中浓度为48.675 ng/mL 的对照品溶液0.5 mL，加1N 盐酸溶液10 mL，涡旋1 min，以350 次/分的频率振摇10 min，精密加入二氯甲烷9.5 mL，涡旋混匀1 min，再以350 次/分的频率振摇10 min，然后以4 000 rmp 的速率离心10 min，取下层二氯甲烷层，以0.22 μm 滤膜滤过，取续滤液。即得1～6 号稳定性试验溶液。精密量取稳定性试验样品溶液2 μL，分别注入气相-质谱仪，记录离子谱图，结果显示：6 份加标浓度为2.433 8 ng/mL 样品溶液测得的NDMA 平均含量为2.362 2 ng/mL，RSD 为3.0%，说明方法重复性良好。

2.7 样品测定结果

A 企业生产的7 批次二甲双胍格列本脲胶囊（Ⅱ）样品经过“1.4”处理制得样品溶液，按照“1.3”项中的仪器条件进行测定。测定结果以盐酸二甲双胍量计算。结果显示：7 批次样品溶液中NDMA 含量均低于检出限，以未检出计。

3 讨论

根据工艺分析，二甲双胍格列本脲胶囊（Ⅱ）中的NDMA 主要为二甲双胍原料药合成工艺中带入。FDA根据The Carcinogenic Potency Database（CPDB数据库）中的毒理学数据，通过换算，列出了可供参考的N-亚硝基二甲胺人体摄入限值为0.096 μg/d。按照二甲双胍格列本脲胶囊（Ⅱ）说明书中描述，日最大剂量不超过8 粒（盐酸二甲双胍2 g，格列本脲20 mg），以盐酸二甲双胍日最大计量计量2 g 计算，N-亚硝基二甲胺在二甲双胍格列本脲胶囊（Ⅱ）中的含量不得过0.048 μg/g（以盐酸二甲双胍计）。结合本研究“1.4”样品溶液盐酸二甲双胍浓度50 mg/mL 计算，NDMA 的限度浓度为2.4 ng/mL，该浓度为本方法设计的“2.2”对照品系列线性溶液的中间浓度点。从测定结果可以看出，A 企业生产的7 批次二甲双胍格列本脲胶囊（Ⅱ）样品均未检出NDMA，表明该企业对于产品中NDMA 的控制较好。

表3 回收率试验

图2 对照品溶液（A）、空白溶液（B）及样品溶液（C）总离子流典型图谱

通过方法学验证可知，方法线性范围宽，线性相关性好；方法检出限为0.005 μg/g，定量限为0.01 μg/g，说明方法灵敏度较高；回收试验结果显示平均回收率为92.41%～101.02%（n=9），RSD（%）为2.4，表明该方法准确度较高，能够很好实现二甲双胍格列本脲胶囊（Ⅱ）中NDMA 基因毒性杂质残留量的准确测定；重复性及精密度试验表现良好。

综上所述，本次实验建立GC-MS/MS 测定二甲双胍格列本脲胶囊（Ⅱ）中NDMA 的方法具有噪音低，专属性强，灵敏度高的特点，可以很好的应用于生产企业对二甲双胍格列本脲胶囊（Ⅱ）中NDMA 基因毒性杂质的日常检测。