马尾藻岩藻聚糖硫酸酯抑制HepG2 细胞的增殖研究

刘诗颖，何坤燕，李英华，朱 冰，谌素华 ，秦小明 ，钟赛意 ，高加龙 ， 陈建平

（1. 广东海洋大学食品科技学院，广东省亚热带果蔬加工科技创新中心，广东湛江 524088；2. 海洋食品精深加工关键技术省部共建协同创新中心，大连工业大学，辽宁大连 116034；3. 广州医科大学附属广州市妇女儿童医疗中心中心实验室，广东广州 510120；4. 广东海洋大学深圳研究院，广东深圳 518108）

0 引言

在我国，癌症问题变得日益突出，每7～8 个人中就有1 人死于癌症。当前，治疗癌症的手段主要有手术、放疗和化疗3 种，然而由于存在药物的耐药性等问题导致治疗效果不理想，治愈率较低。因此，从自然界中筛选天然高效无毒的抗肿瘤药物成为目前的研究热点。

马尾藻是一种产自中国广东、海南等地的褐藻，其资源丰富[1]。据统计，全国共有130 种马尾藻属[2]，其中23 种在广东沿海海域分布较多[3]。近年来，研究报道马尾藻中富含具有多种生物活性的岩藻聚糖硫酸酯（Fucoidan）[4-7]。有研究发现，马尾藻是一种广泛存在于褐藻及海洋无脊椎动物当中的含硫酸基的杂聚糖[8-9]。相关研究人员从Focus vesiculosus 中提取得到岩藻聚糖，发现其能够抑制脂质的积累[10]。课题组前期在马尾藻多糖方面开展了系列研究，研究表明马尾藻岩藻聚糖硫酸脂具有较好的抗氧化和降血脂效果[11-16]。然而，关于其抗肿瘤活性的研究报道较少。故选择HepG2 细胞作为研究对象，采用MTT方法、流式细胞术和检测ROS 含量考查马尾藻岩藻聚糖硫酸酯抑制HepG2 细胞增殖的能力，为马尾藻岩藻聚糖硫酸酯在抗肿瘤临床药物的应用开发中提供新的科学依据和技术手段。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

马尾藻岩藻聚糖硫酸脂，实验室自制；人肝癌HepG2 细胞，美国ATCC 细胞库提供；正常人肝LO2 细胞，中国科学院（上海） 细胞库提供；胎牛血清、DMEM培养基，美国Gibco 公司提供；噻唑蓝（MTT），美国Hyclone 公司提供；细胞周期检测试剂盒，江苏凯基生物技术股份有限公司提供；活性氧检测试剂盒，上海碧云天生物技术有限公司提供。其他试剂（分析纯），国药集团提供。

1.2 仪器与设备

BP301S 型电子天平，德国Sartorius 公司产品；Versamax 酶标仪，美国Molecular Devices 公司产品；FACS Aria 流式细胞仪，美国Waters 公司产品。

1.3 马尾藻岩藻聚糖硫酸脂的提取

参考刘海韵等人[17]的方法提取马尾藻岩藻聚糖硫酸脂。取适量马尾藻粉，按1∶30（g∶mL） 料液比加入蒸馏水，采用超声波辅助水提法，经离心、浓缩后，脱除褐藻胶、脂肪，真空冷冻干燥后获得粗提物。加蒸馏水150 mL 溶解2 g 的粗提物，然后加Sevage 试剂，经离心、透析后，真空冷冻干燥得到粗多糖。最后，用0.5 mol/L NaOH、0.5 mol/L HCl、0.5 mol/L NaCl 溶液活化DEAE-52 纤维素，将活化后的DEAE-52 纤维素装入层析柱后，用1.0 mol/L NaCl 溶液对粗多糖溶液进行洗脱，对应洗脱出的组分即为纯化后的马尾藻岩藻聚糖硫酸脂。

1.4 细胞培养

细胞培养在含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和50 U/mL 链霉素的DMEM 完全培养液中。细胞置于培养箱中培养（37 ℃，5% CO2），根据细胞生长情况进行传代，取对数期细胞进行试验。

1.5 MTT 检测马尾藻岩藻聚糖硫酸脂抑制HepG2 和LO2 细胞生长的效果

将细胞密度为 2×104、5×104个细胞 / 孔的HepG2 细胞和LO2 细胞接种于96 孔板，放入37 ℃的二氧化碳培养箱中培养24 h。加入不同浓度马尾藻岩藻聚糖硫酸脂100 μL 处理细胞24 h 后，往96孔板中加入5 mg/mL MTT，每孔20 μL，置于培养箱（37 ℃，5% CO2） 中孵育4 h，用移液器移去上清液后，每孔加入DMSO 150 μL，经摇床振荡10 min后，使用酶标仪（SpectaMax 250） 测定各孔在570 nm 处的光密度（OD） 值。以空白对照组的OD 值为100%，计算细胞存活率。

细胞存活率的计算见公式（1）：

式中：Ai——不同处理组OD 值；

A0——空白对照组OD 值。

1.6 流式细胞仪分析马尾藻岩藻聚糖硫酸脂对HepG2 细胞生长周期的影响

取对数期生长的肿瘤细胞，以2×104cell/mL 细胞密度铺6 cm 培养皿，24 h 后分别按如下方式进行加药处理。其中，对照组不加药；马尾藻岩藻聚糖硫酸酯组加入不同浓度的马尾藻岩藻聚糖硫酸酯[18]。将培养皿放入培养箱中培养一定时间。用PBS 清洗2～3 次后用胰酶消化，然后收集细胞。参考细胞周期检测试剂盒说明书进行操作，用PBS 洗涤细胞一次（以转速2 000 r/min 离心5 min） 收集并调整细胞浓度为1×106/mL，取1 mL 单细胞悬液，离心后，去除上清液，在细胞中加入70%冰乙醇500 μL 固定，置于-20 ℃冰箱中过夜。以转速1 000 r/min 离心3 min 去掉冰已醇，加入500 μL PI/RNase A 染色工作液，室温避光30 min 后上机待测。每个样品至少分析10 000 个细胞。

1.7 ROS 含量检测

取对数生长期的肿瘤细胞置于6 孔板上预培养24 h，分别按如下方式进行加药处理。其中，对照组不加药；马尾藻岩藻聚糖硫酸酯组加入不同浓度的马尾藻岩藻聚糖硫酸酯。在培养箱中培养一定时间后，参考活性氧检测试剂盒说明书进行操作。在37 ℃下，用10 μmol/L DCFH-DA 孵育细胞20 min，细胞经无血清培养基洗涤后，用PBS 重悬细胞，然后在荧光酶标仪下检测各组的荧光强度值变化。

2 结果与分析

2.1 不同质量浓度的马尾藻岩藻聚糖硫酸脂对HepG2 细胞存活率的影响

采用MTT 方法评价马尾藻岩藻聚糖硫酸脂对人肝癌HepG2 细胞存活率的影响，以正常肝LO2 细胞做对照。

不同质量浓度的马尾藻岩藻聚糖硫酸脂对HepG2 和LO2 细胞存活率的影响见图1。

图1 不同质量浓度的马尾藻岩藻聚糖硫酸脂对HepG2 和LO2 细胞存活率的影响

由图1 可知，在马尾藻岩藻聚糖硫酸脂质量浓度为0.5～4.0 mg/mL 内，随着质量浓度的升高，马尾藻岩藻聚糖硫酸脂对HepG2 细胞和LO2 的存活率呈逐渐降低趋势，分别从88.78±0.05（0.5 mg/mL）、95.85±0.01（0.5 mg/mL） 降低到 43.94±0.07（4 mg/mL）、74.46±0.04（4 mg/mL），这表明马尾藻岩藻聚糖硫酸脂对HepG2 细胞的抑制活性要强于正常肝LO2 细胞，表明具有较好的细胞选择性。当马尾藻岩藻聚糖硫酸脂的质量浓度达到8 mg/mL 时，其对HepG2细胞和LO2 的存活率分别达到最大为11.61±0.002和25.11±0.001，研究表明马尾藻岩藻聚糖硫酸脂在较高质量时，对正常细胞也会造成巨大的损伤。故后续试验质量浓度选择在0.5～4.0 mg/mL 以内。

2.2 不同质量浓度的马尾藻岩藻聚糖硫酸脂对HepG2细胞生长周期的影响

采用1，4 mg/mL 的马尾藻岩藻聚糖硫酸脂作用于HepG2 细胞24 h 后，运用流式细胞仪检测HepG2细胞凋亡情况。

马尾藻岩藻聚糖硫酸脂在不同质量浓度下对HepG2 细胞周期的影响见图2。

图2 马尾藻岩藻聚糖硫酸脂在不同质量浓度下对HepG2 细胞周期的影响

由图2 可知，经1，4 mg/mL 马尾藻岩藻聚糖硫酸脂处理后的HepG2 细胞凋亡率SubG1 峰从空白对照组的2.14%分别提高到16.6%和19.37%，且处于G0/G1 期的细胞从空白对照组的39.80%分别提高到53.73%和61.42%，上述试验结果表明，马尾藻岩藻聚糖硫酸脂通过诱导细胞凋亡和G0/G1 期细胞周期阻滞来抑制细胞的增殖。

2.3 不同质量浓度的马尾藻岩藻聚糖硫酸脂对细胞内ROS 含量的影响

1，2，4 mg/mL 的马尾藻岩藻聚糖硫酸脂对ROS含量的影响。

不同质量浓度的马尾藻岩藻聚糖硫酸脂对细胞内ROS 含量的影响见图3。

由图3 可知，在5 min 内，相比空白处理组，1，2，4 mg/mL 马尾藻岩藻聚糖硫酸脂处理细胞后，细胞内ROS 含量明显升高，分别从100%提高到364.16%，489.98%，560.87%，随着处理时间的延长，ROS 含量均呈下降趋势，到60 min 之后这种下降趋势变得较平缓，这可能是由于细胞在受到马尾藻岩藻聚糖硫酸脂刺激后，短时间细胞内产生大量的活性氧（ROS），随着处理时间的延长，细胞内的抗氧化酶系统发挥作用清除细胞内的ROS，导致ROS 含量呈下降趋势，由于ROS 过多，无法完全清除，最终导致ROS 含量下降趋势变得较平缓。

图3 不同质量浓度的马尾藻岩藻聚糖硫酸脂对细胞内ROS 含量的影响

3 结论

运用MTT 测定了马尾藻岩藻聚糖硫酸脂对HepG2 肝癌细胞存活率的影响，并运用流式细胞仪和检测细胞内ROS 含量初步探究马尾藻岩藻聚糖硫酸脂抑制HepG2 增殖的机理。得到的结论如下：

（1） 经马尾藻岩藻聚糖硫酸脂处理HepG2 细胞24 h 后，能显著降低细胞的存活率，在测试质量浓度内，细胞存活率最低达到11.61%±0.002%，上述结果表明，马尾藻岩藻聚糖硫酸脂对HepG2 肝癌细胞具有较强的抑制效果。

（2） 经流式细胞仪检测细胞周期发现，HepG2细胞经马尾藻岩藻聚糖硫酸脂处理24 h 后，能显著提高凋亡细胞数目和G0/G1 期的细胞数目，进一步检测细胞内ROS 含量发现，马尾藻岩藻聚糖硫酸脂处理细胞后能够提高细胞内ROS 的含量，上述结果表明，马尾藻岩藻聚糖硫酸脂通过诱导细胞内ROS的产生导致细胞发生凋亡和G0/G1 期阻滞,从而抑制HepG2 细胞的增殖。