国内部分地区猪场猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测及高致病性毒株的分离与毒力鉴定

沙俊舟，焦文涛，丁旭娜，段进坤，车艳杰，鲍恩东1,*

(1.南京农业大学动物医学院，南京 江苏 210095；2.天津瑞普生物技术股份有限公司研究院，天津 300308)

猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是一种高度接触性猪的传染病，可引起母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道异常等病症。PRRS由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起，因其可引起病猪耳部和皮肤发绀，又称猪蓝耳病。上世纪80年代末到90年代初，PRRS在北美和欧洲相继暴发，并迅速扩散、传播至许多养猪国家和地区[1-2]。该病病原先后在欧洲、美国被分离到，虽然两株病毒的基因组结构和引起的症状相似，但是他们的核苷酸相似度只在60%左右，所以PRRSV就被分为北美型和欧洲型两个基因型[3-4]。1995年，PRRS传入中国，毒株属美洲型[5-6]。2006年，中国南方地区又暴发了PRRS，该病病原为美洲型的突变株，命名为高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(highly pathogenic PRRSV，HP-PRRSV)，该病毒的nsp2区域和经典株相比，存在30(1+29)个不连续氨基酸的缺失[7-8]。2014年开始，有人从我国养猪场分离到一类与 2008 年在美国分离到的NADC30毒株有很高的核苷酸相似性的 PRRSV；自此，这类毒株在我国养猪场中开始被频繁发现，人们将此类毒株命名为类 NADC30(NADC30-like)毒株[9-10]。目前，我国PRRS防控形势严峻，PRRS在我国呈现出全国性流行的态势，且流行毒株具有多样性[11-14]。在众多毒株中，高致病性毒株致病性强，临床症状严重，极大地危害着养猪业的发展，仍需引起高度重视。

PRRSV为单股正链有囊膜的RNA病毒，属套式病毒目、动脉炎病毒科中的猪动脉炎病毒属[15]。病毒全长大约为15.0～15.4 kb，不同毒株的病毒大小差异主要集中在ORF1a上的nsp2基因区域。病毒5′端有非编码区和帽状结构，3′端也存在非编码区和poly(A)[16]。PRRSV至少包含10个开放阅读框(ORFs)。其中，ORF1a和ORF1b占病毒基因组全长的3/4，分别编码病毒的复制酶多聚蛋白pp1a和pp1ab，并且能被自剪切成14个非结构蛋白(nsps)，从5′到3′分别为nsp1α/β、nsp2-6、nsp7α/β和nsp8-12，参与病毒基因组的复制和转录[17]。ORF2～ORF5、ORF6、ORF7占据基因组剩下的1/4，分别编码病毒的囊膜蛋白GP2～GP5、膜基质蛋白M和核衣壳蛋白N[16]。位于ORF1a中的nsp2基因变异程度最大，最多可容忍400个氨基酸的缺失，是不同毒株的主要鉴别位点。随着PRRSV重组和变异的频率加剧，GP5基因也在遗传变异分析中作为基因分型的依据[18-19]。

本研究主要采用国标RT-PCR方法[20-21]，对2017 至 2019年间采集自国内14省(市)的临床发病动物疑似样本，进行了流行病学调查，并以此分离到一株PRRSV毒株(命名为RP19)，对该分离病毒的nsp2和ORF5进行序列分析，并通过动物回归试验等确定了该毒株的致病性，为PRRS的防控及疫苗研制提供了一定的参考依据。

1 材料与方法

1.1 病料样品来源

病料自安徽省、河北省、河南省、江苏省、江西省、山西省、陕西省、湖北省、山东省、福建省、甘肃省、北京市、天津市、上海市14省、市的多个不同规模猪场。组织、精液以及脐带血等共1 441份样品均由天津渤海农牧联合研究院监测中心分别于2017至2019年间收集并提供。

1.2 试验动物、细胞及试剂

7头约5周龄试验用仔猪购自天津市周边猪场，均为经PRRSV、PRV、PCV2核酸检测阴性和PRRSV ELISA抗体检测阴性的健康试验猪；Marc-145细胞、鼠源PRRSV N蛋白单抗由天津瑞普生物技术股份有限公司生物制品研究院提供；DH5α购自上海唯地生物公司；pEASY-Blunt载体购自北京全式金生物公司；RNAisoPlus、ExTaq酶、反转录试剂盒购自宝生物工程公司；Phanta高保真DNA聚合酶购自南京诺唯赞生物公司；山羊抗小鼠Alexa Fluor®488标记的二抗购自艾博抗贸易有限公司；胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒购自天根生化科技公司；PRRSV Ab ELISA试剂盒购自北京金诺百泰生物公司。

1.3 引物的设计合成

采用国标引物对收集到的病料进行扩增。GB2008为PRRSV的鉴定引物，GB2011为PRRSV分型引物，可鉴别经典株和HP株。此外，根据GenBank中发布的PRRSV序列，设计2对特异性引物用于部分nsp2基因和ORF5基因的序列扩增，引物由金唯智生物公司合成(表1)。

表1 扩增引物序列

1.4 病毒检测

1.4.1 样品处理

分别剪取0.3 g左右的病料组织(肺脏、胸腺、淋巴结等)，置于2 mL离心管中，加入1 mL PBS，于匀浆器中进行研磨匀浆，13 000 r/min离心5 min，取上清液转移至新的1.5 mL离心管中，-20 ℃冻存备用。

对于脐带血样品，将血液静置析出血清后，加入2 mL于离心管中，3 000 r/min离心5 min，取上清转移至新的1.5 mL离心管中，-20 ℃冻存备用。

对于精液样品，将其混匀后，置于1.5 mL离心管中，-20 ℃冻存备用。

1.4.2 核酸的提取与RT-PCR鉴定

取200 μL样品，根据RNAiso Plus参考说明进行RNA提取，使用PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit进行cDNA反转录，用ExTaq酶分别对两组引物进行PCR扩增。

12.5 μL的体系分别为：①10×PCR Buffer 1.25 μL、dNTPs 0.5 μL、GB2008上、下游引物各0.5 μL、ddH2O 7 μL、ExTaq酶 0.25 μL、cDNA模板 2.5 μL；②10×PCR Buffer 1.25 μL、dNTPs 0.5 μL、GB2011 P1、P2、P3引物各0.5 μL、ddH2O 6.5 μL、ExTaq酶 0.25 μL、cDNA模板 2.5 μL。

扩增程序分别为：①95 ℃预变性5 min；95 ℃变性1 min，51 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃最后延伸10 min；②95 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，59 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，35个循环；72 ℃最后延伸10 min。

PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳120 V，30 min进行检测。

1.5 病毒的分离鉴定

1.5.1 PAM的制备

将6～8周龄的PRRSV、PCV2核酸和抗体检测阴性的仔猪动脉放血致死后，从喉头部切开，止血钳尽量靠上夹住气管(密闭)，下端勿夹住肺，无菌操作取出肺，用无菌PBS冲洗至无新鲜血液，进入无菌间，用酒精点燃擦拭肺脏表面。用灭菌剪刀尽量剥离气管周围的粘连物，用灭菌镊子夹住肺气管侧壁，用50 mL注射器向肺脏灌含8%双抗的PBS 150～200 mL，轻轻揉捏拍打，使肺泡充分打开。将灌洗液倾入瓶口覆有无菌双层纱布的三角瓶中，重复灌洗3～4次，收集灌洗液(约500 mL)，直至肺脏间隙呈透明状。灌洗液1 000 r/min离心10 min，弃上清液。沉淀物用20 mL含10%新生牛血清的PRMI1640培养基重悬，1 000 r/min离心10 min。用培养基将细胞重悬，10倍、100倍稀释后进行细胞计数，使六孔板每孔含5×105个细胞。

1.5.2 病毒的分离

将PCR鉴定为HP毒株的阳性病料组织上清液用0.22 μm滤器过滤后，分别接种PAM细胞和Marc-145细胞。将生长良好的6孔板细胞培养基弃去，用PBS冲洗细胞2次，按病毒液与培养基1∶10的比例接种。37 ℃孵育1 h，弃去上清液，使用含3%新生牛血清的培养基2 mL，置于细胞培养箱中继续培养3～5 d，传2～3代，约80%细胞出现CPE后收取样品，将病毒液置于-80 ℃保存备用。

1.5.3 病毒滴度测定

用长满单层Marc-145细胞的96孔细胞培养板进行病毒滴度测定。将在Marc-145细胞上稳定传代的第3代病毒，用含2%新生牛血清的DMEM培养基作10×倍比稀释，取10-2～10-6稀释度的病毒液分别接种96孔细胞培养板。每个稀释度接种8孔，每孔100 μL。同时设8孔作为阴性对照，每孔再补加100 μL 维持培养基。置于37 ℃ 5% CO2细胞培养箱中培养，每日观察细胞病变，连续观察4～5 d，记录每个稀释度出现CPE的孔数。采用Reed-Muench法计算TCID50。

1.6 病毒电镜观察

将接毒后的Marc-145细胞培养72 h后，反复冻融3次，10 000 r/min 离心15 min，去掉细胞碎片。取上清液，加入终浓度7%的PEG6000，混匀后于4 ℃过夜沉淀。将PEG与病毒的混合液10 000 r/min离心30 min。弃去上清，用 1.5 mL 无菌PBS重悬附着于离心管底部的病毒粒子，负染后进行电镜观察。

1.7 间接免疫荧光试验(IFA)

将Marc-145细胞上培养24 h的第3代病毒，弃去培养基，用PBS洗涤3次。使用-20 ℃预冷的甲醇在-20 ℃环境下固定细胞10 min。除去甲醇，用PBST清洗2次，每次5 min。以2%的BSA溶于PBST作为稀释液，按1∶2 000的比例对鼠源单抗进行稀释，加入单抗，37 ℃孵育1 h。PBST清洗3次细胞，每次5 min。用1∶1 000比例以上述稀释液稀释Alexa Fluor®488标记二抗，加入二抗，37 ℃孵育1 h。PBST清洗3次细胞，每次10 min。在荧光显微镜下观察结果。

1.8 扩增nsp2基因和ORF5基因

以Phanta高保真酶分别扩增RP19的nsp2基因和ORF5基因。PCR扩增体系为50 μL，2×Phanta Max Master Mix 25 μL、ddH2O 19 μL、上、下游引物各2 μL，cDNA模板2 μL。PCR扩增程序：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃最后延伸5 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。将目的条带裁切回收，胶回收后，根据说明书方法连接pEASY-Blunt载体，并转化DH5α感受态。涂布过夜后挑取经PCR鉴定为阳性的菌落，提取质粒送往金唯智生物公司测序。

1.9 序列分析

从GenBank上下载国内外PRRSV代表毒株，毒株信息见表2。将nsp2和ORF5基因的序列通过Lasergen与Mega 7.0软件进行序列比对，构建进化树，并把氨基酸序列与代表毒株进行比对分析。

表2 PRRSV参考毒株信息

1.10 动物回归试验

取7头试验仔猪，随机分为2组，其中攻毒组5头和对照组2头。攻毒组的每头仔猪滴鼻2 mL，病毒含量105.0TCID50/mL。对照组滴鼻DMEM 2 mL。每日进行直肠测温，并观察临床症状。在攻毒后0、3、7、11、21 d分别采血，分离血清，使用PRRSV Ab ELISA试剂盒检测N蛋白抗体。每7日进行一次体重测量，连续观察21 d。所有存活仔猪采用安乐死在21 d进行剖检。观察其肺脏大体的病变，并用10%福尔马林溶液固定保存肺组织，以备组织病理学检查。

2 结果

2.1 病料样品RT-PCR检测

通过对14个省(市)共计1 441例疑似病料的GB2008引物检测，部分样品扩增结果见图1。经RT-PCR扩增为阳性的病料有319份，阳性检出率为22.14%，其中病料阳性检出率较高的地区有江西省41.94%(39/93)、安徽省39.73%(29/73)、上海市35.94%(23/64)。病料阳性检出比例较低的地区有福建省17.35%(17/98)、江苏省10%(3/30)、天津市6.9%(2/29)。经GB2011引物扩增为HP-PRRSV感染的样品有169例，占阳性病料的52.98%(169/319)，说明感染了HP-PRRSV，该毒珠仍为近几年PRRSV的流行毒株。

2.2 病毒的分离

将处理的阳性病料上清液接种PAM细胞，只有1份病料接种72 h后产生明显的细胞病变，表现为细胞破碎、皱缩、脱落；其他阳性病料未出现细胞病变，盲传3代后仍未出现病变弃掉。该毒株命名为RP19。将RP19株接种Marc-145细胞后，细胞病变时间显著增长。96 h只是出现细胞部分变圆和聚集，直到120 h才出现细胞破碎、脱落现象。

2.3 病毒滴度测定

经TCID50测定，RP19于Marc-145细胞上第3代的病毒含量为105.9TCID50/mL。

M.DL2000 DNA Marker；1～8.部分检测样品；9.阳性对照；10.阴性对照;A.GB2008引物扩增结果;B.GB2011引物扩增结果图1 部分样品的PCR扩增结果

2.4 病毒电镜观察

病毒样品经过负染后，透射电镜下可观察到呈现球状的病毒粒子，直径约50～72 nm，表面有微小的纤突，见图2。

图2 病毒粒子透射电镜观察

2.5 间接免疫荧光试验

对在Marc-145细胞上培养24 h的RP19进行间接免疫荧光试验观察。正常细胞，无绿色荧光(图3A)，而大量病毒感染细胞出现特异性绿色荧光(图3B)。

A.阴性细胞对照;B.RP19感染24 h后的细胞图3 PRRSV间接免疫荧光测试结果(100×)

2.6 nsp2基因和ORF5基因的扩增

分别对nsp2和ORF5基因对RP19株进行PCR扩增。经琼脂糖凝胶电泳检测，nsp2目的条带大小为950 bp，ORF5目的条带大小为640 bp(图略)，均与预期结果相符。

2.7 序列分析

使用MEGA7.0软件，采用Neighbor-Joining法对RP19与国内外代表性毒株分别进行nsp2基因和ORF5基因的进化树构建。美洲型分为以VR-2332为代表的经典株、以JXA1为代表的HP株和以NADC30为代表的NADC30-like毒株。RP19株在进化树上属于HP毒株，与TJ株最为接近。

使用MegAlign软件对nsp2基因和ORF5基因和国内外代表毒株进行氨基酸序列比对，结果如图4显示。RP19毒株的nsp2基因具有典型HP毒株特征，即与经典毒株相比具有30(1+29)个氨基酸的不连续缺失。ORF5基因的氨基酸比对结果显示，虽然核苷酸有些许不同，但为氨基酸不变的同义突变，RP19的信号肽、中和表位和3段跨膜区都与JXA1、TJ、HuN4等HP株一致(图4)。nsp2与ORF5基因的序列分析结果表明，此次分离RP19株为典型的HP-PRRSV。

图4 ORF5基因氨基酸对比结果

2.8 动物回归试验

5周龄受试仔猪在感染RP19毒株后第3天后开始出现体温升高，持续约7～10 d，体温在攻毒后的第5～8天时达到高峰，13 d后体温逐渐下降并恢复至正常(图5)。攻毒后受试仔猪出现采食减少、精神沉郁等症状。于攻毒后第4天出现呼吸急促、喜卧等症状，并伴有咳嗽、喷嚏。攻毒后第7天受试仔猪出现皮肤潮红、颤抖、后肢麻痹等症状。5头仔猪在感染后期出现1头死亡。阴性对照组的各受试仔猪在整个试验过程中体温、采食和精神状态均表现正常，未观察到任何异常现象。

图5 试验仔猪直肠温度变化

各组受试仔猪在攻毒前均称量体重并记录。此后每周测一次，于试验结束宰杀后分析其体重增长情况，试验结果见图6。攻毒组猪在0～7 d、7～14 d、14～21 d这3个时间段的日增重均显著低于对照组(P<0.01)。

**表示差异极显著(P<0.01)图6 试验仔猪平均日增重

各组受试仔猪血清中抗行检测结果显示，仔猪在攻毒前抗体水平均处于检测限以下，对照组受试仔猪在整个试验期间的血清抗体水平均为阴性，而攻毒组受试仔猪的血清抗体于第7天开始被检测到，随后抗体水平随着试验时间的延长而不断升高，直到试验结束(图7)。

图7 试验仔猪血清中PRRSV抗体水平变化

在攻毒后21 d对所有存活试验猪均进行安乐死并剖检。剖检结果显示，攻毒组仔猪的肺脏出现淤血水肿，肺脏边缘出现实质性病变(图8)。病理组织学观察结果显示，攻毒组仔猪的肺脏出现以弥散性间质性肺炎为特征的变化，肺间质中结缔组织出现增生，肺泡巨噬细胞数量增多，肺泡间隔淋巴细胞和单核细胞浸润，大部分肺泡消失，剩余的肺泡出现代偿性扩张(图9)。

A.对照组仔猪肺脏;B.攻毒组仔猪肺脏图8 仔猪肺脏大体观察

A.对照组肺组织；B.攻毒组肺组织间隔明显增宽，肺泡消失且有代偿性肺泡扩张图9 仔猪肺脏的病理组织学变化(100×)

3 讨论

PRRS是一种对全球养猪业具有重大影响的传染病。从上世纪80年代在美国被首次分离后就一直影响着养猪业的发展。我国PRRS的流行经历了三个阶段：1996年以Ch-1a为代表的经典株流行；2006年以JXA1为代表的HP株流行；2014年至今以NADC30为代表的类NADC30株流行。PRRSV为RNA病毒，极易变异，其ORF1a编码的nsp2基因能忍受大片段的基因突变和缺失，并且这种突变可不断地累加。另外，不同毒株之间会频繁发生基因重组[11,21]。尤其是国外引种、免疫弱毒活疫苗等方式不规范等，导致了国内国外毒株的重组、野毒疫苗毒毒株的重组等问题，而且弱毒疫苗存在毒力返强风险，加剧了PRRS的流行。

PRRS是影响我国养猪业时间最持久、损失最严重的动物疫病之一，尤其是2006年暴发的HP-PRRS，由于其高致病率和高死亡率的特征，对我国养猪业造成了巨大的经济损失。

本研究以国标RT-PCR检测方法为基础，通过对2017至2019年期间采自我国14省(市)的1 441份PRRS感染疑似病料进行检测而开展起来的。结果显示，共有319份病料样品的检测结果为阳性，阳性率为22.14%，其中HP-PRRSV感染的样品约占阳性病料的52.98%，说明HP-PRRS至今已经在国内养猪场广泛流行，仍需对其进行重点防范。另外，PRRS在不同地区养猪场的流行状况是存在一定差异的，江西、安徽、上海等地养猪场中PRRS的感染情况比较严重，HP-PRRSV株占大多数，需要进行针对性的防控。

通过对筛选到的PRRS阳性病料进行处理，并接种到PAM细胞和Marc-145细胞，利用电镜观察、IFA以及HP-PRRSV特异性引物进行鉴定、动物回归试验等方法，成功分离到1株HP-PRRSV(RP19)。因2019年采集到的病料较少，且病料没有立即进行病毒分离，目前只分离到1株病毒。为进一步探究该毒株RP19的遗传演化规律，对其关键性的nsp2基因和ORF5基因进行测序分析，结果显示RP19与HP代表毒株TJ株最为接近。ORF5基因编码GP5蛋白，GP5蛋白存在免疫原性较高的抗原表位，而抗原表位一定程度上决定了病毒的免疫特性。在ORF5的比对中发现，GP5蛋白重要的氨基酸位点未发生突变，呈现典型的HP毒株的特点。为了验证RP19的致病性，本文还对5周龄仔猪进行了攻毒试验，试验结果表明，RP19株能引起仔猪严重的临床症状，有一定的致死毒力，可引起感染仔猪发生弥散性间质性肺炎等病理变化及相应的临床症状。

由于HP-PRRS依然为国内流行毒株，HP-PRRSV占PRRSV阳性样品的52.98%，且存在高度传染性、致病性，因此以HP-PRRSV为抗原制备疫苗预防PRRS非常必要。本研究结果为国内PRRSV的疫苗生产和使用提供了一定的试验依据。