环境DNA技术在长江口水生生物监测中的应用潜力

王学昉,孟维钊,王丛丛,张云飞,田思泉*,高春霞,韩东燕,陈锦辉,吴建辉

(1.上海海洋大学海洋科学学院，上海 201306; 2.国家远洋渔业工程技术研究中心，上海 201306; 3.大洋渔业资源可持续开发教育部重点实验室，上海 201306; 4.农业农村部大洋渔业开发重点实验室，上海 201306; 5.农业农村部大洋渔业资源环境科学观测实验站,上海 201306; 6.上海科技馆自然史研究中心,上海 200041; 7.上海市水生野生动植物保护研究中心,上海 200092)

河口是生态环境十分脆弱和敏感的水域，其对生物种群的繁衍、资源补充及保持生态平衡都具有十分重要的意义[1]。长江口是我国最大的河口，该区域饵料生物丰富，是多种海洋生物的良好栖息地、产卵场和洄游通道[2]。了解长江口地区的生物资源动态变化是保护其水域生态健康的前提，为更好地了解和保护该水域的生态系统，需要建立有效的水生生物监测体系。

水生生物监测调查，特别是渔业资源调查，按照是否依靠渔业活动获取数据分为依赖于渔业的调查(Fishery-dependent Survey)和独立于渔业的调查(Fishery-independent Survey)[3]。在当前长江流域实行长期禁渔的背景下，很难再获取渔业数据或基于渔业的调查数据，因此需要发展多元的独立监测技术来健全传统的资源监测体系。

随着分子生物学的蓬勃发展，20世纪80年代环境DNA (Environmental DNA, eDNA) 技术孕育而生，逐渐成为一种新兴的生物监测技术。该技术最大的优势是环境友好，只需要从环境中采集水样，就可以了解到环境中的生物信息，不会对监测对象造成伤害，因此十分适合监测濒危或珍稀物种[4]；其次，单一的采样方法常常不能全面地采集群落中的所有生物，如底拖网一般只对底层鱼类的捕获率较高[5]，而环境DNA技术可以同时监测游泳动物、底栖生物甚至包括浮游动植物、细菌、真菌和病毒等[6]。

长江口水域仅鱼类就有140多种，还有中华鲟(Acipensersinensis)、江豚(Neophocaenaphocaenoidesasiaeorientalis)、松江鲈(Trachidermusfasciatus)等珍稀水生生物，具有多种监测需求[7]。本研究从环境DNA技术的原理、发展、限制条件等方面介入，结合长江口具体的监测需求和环境特点，对该水域使用环境DNA技术进行监测的潜力进行展望，以期为长江大保护工作提供更加丰富的参考信息。

1 环境DNA技术的监测原理与发展

环境DNA是生物体扩散于环境中的DNA，来源可以是脱落的细胞和组织，也可以是排泄物或粘液[8]。环境DNA技术是在确定调查物种或种群的特异性基因识别片段的基础上，检测从环境介质中提取环境DNA的种类与数量，进而确定取样环境中生物的种类与数量，以达到监测目标物种的目的的技术[9]。

环境DNA技术起源于微生物领域，最早被用于分离纯化环境中微生物的DNA[10]，随后逐渐被应用于植物群落多样性等领域[11]，主要用于测定空气中的植物孢子，后来才被用于监测水生动物。Ficetola等(2008)最先将环境DNA技术应用于淡水入侵物种的监测[12]；Thomsen等(2012)首次使用环境DNA技术分析海洋中的生物多样性，扩大了环境DNA技术的应用水域[13-14]。从2008年至今，环境DNA技术经历了由监测单一物种到多个物种，再到调查生物多样性的历程，目前已发展到可评估部分物种的资源量；其适用水体也从流动性较小的封闭淡水水体(如池塘、湖泊)，扩展至开放水体(如溪流、河流)，最终应用于盐水、半盐水水域(如河口、近海)；监测对象由小型底栖动物发展到两栖动物、鱼类、哺乳动物甚至是水禽。

2 环境DNA技术在水生生物监测中的应用

目前，环境DNA技术在水生生物监测中主要使用在四个方面，一是监测特定物种，如濒危物种和入侵物种；二是调查生物多样性；三是评估资源量；四是监测物种的遗传多样性。前两方面的技术发展较为成熟，因此应用也较多，而在对于资源量的评估与遗传多样性的监测方面仍处于探索阶段。

2.1 特定物种

2.1.1 珍稀物种和濒危物种 珍稀动物和濒危物种在自然界的密度很低，利用常规性的调查监测它们的存在具有固有的困难。对于淡水生态系统的低密度目标物种，已可通过环境DNA技术监测其存在与否[10]。这是因为生物的环境DNA通过在水体中的快速扩散，可以在一定范围内的任意地点被检测到[4]；环境DNA技术还能监测到任何生活史阶段的目标物种[15]，极大地避免了调查网具网目尺寸选择性的约束；环境DNA技术还是一种环境友好型的监测方法，监测过程本身不会对目标物种和栖息地造成物理伤害，这对于珍稀濒危物种及脆弱的生境而言相当重要。

目前，环境DNA技术已成功应用于河口、河流及池塘的珍稀或濒危的鱼类[15]、两栖类[16]、水生哺乳动物[17]的监测，表现出了独特的优势。在长江流域，Ma等(2016)设计出适合长江江豚的特异性引物，使用环境DNA技术对长江江豚进行了调查[17]；Stewart等(2017)通过环境DNA的信息推测出长江江豚种群的时空分布[18]；Qu等(2019)在以长江江豚为对象的监测中，发现传统实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR， qPCR)较传统视觉观察与捕获相比，其覆盖面积更广，且成本更低[19]；徐念等(2018)使用该技术对中华鲟的生殖洄游路线进行了分析，并认为其结果很好的反映了中华鲟的季节性洄游模式[20]；吴昀晟等(2019)对江苏江段的长江江豚分布进行了调查，并与传统方法比较后发现，8个使用传统方法观测到江豚的站点均检测到了江豚的DNA，10个疑似站点中3个检测到了江豚的DNA[21]。这些研究都表明在长江流域使用环境DNA技术监测珍稀物种活动的可行性。

2.1.2 入侵物种 入侵物种是指对经济生产、生态系统和生物多样性、人类健康等带来威胁的外来物种[22]。生物入侵是导致生物多样性丧失的重要原因之一[23]。环境DNA技术能够应用于入侵物种的监测，特别是在外来物种入侵的早期阶段，其种群密度比较低，往往并不引人注意，但此时也是最佳防控时机，如果失控将导致防除成本急剧增加，甚至难以根除。因此，在外来种入侵或扩散初期施行有效监测、预警至关重要，而环境DNA技术在这一阶段较传统监测方法具有更为明显的优势。

目前，使用环境DNA技术在监测入侵物种方面已有多个成功案例，如Ficetola等(2008)发现环境DNA技术不仅能在所有传统方法奏效的水体中监测到美国牛蛙(Ranacatesbeiana)，还能在一些传统方法失败的地点进行成功监测[12]；Jerde等(2011)将环境DNA技术结合传统渔业资源调查监控劳伦斯河流域的入侵物种，发现真实的威胁程度远高于传统方法的估计[24]。目前监测水生入侵物种时常使用的方式是走访调查和传统网具捕捞相结合[25]，偶尔会使用遥感技术研究入侵物种的分布状况[26]，这几种监测方式在入侵早期的敏感性较低，且成本较高[27]。长江口水域是国际航线的交通要塞，远洋船舶的压舱水是造成生物入侵的重要途径[28]。目前，国内对压舱水内入侵物种的鉴定方法主要是采用形态学观察结合分子生物学的方法[29]，而美国研究人员已经将环境DNA技术应用于压舱水的检测[30]。

2.2 生物多样性

生物多样性具有极高的价值，物种的过度缺失会造成生态失衡[31-32]。生物多样性涉及遗传多样性、物种多样性、生态系统多样性3个层次[33]，环境DNA技术在物种多样性的监测上也具有适用性。Thomsen等(2012)利用环境DNA信息发现能在封闭的实验生态系统中检测到两栖类和所有鱼类，相比之下，开放的海洋环境中可能由于洋流和盐度等环境因素的影响，环境DNA技术只能检测出部分物种，但相比于潜水、底拖网、笼壶等传统调查方法，其监测效率明显更高[14]。然而，Foote等(2012)使用环境DNA技术监测开阔水域的生物群落时，发现其对于领航鲸(Globicephalamelas)的灵敏性就低于传统声学调查技术，这可能是由于海水中的环境DNA被稀释后密度过低所致[34]。在长江流域，徐念等(2016)在宜昌至南京江段的对比调查表明，渔获物调查最少采样到17种鱼类，而利用环境DNA只检测出15种鱼类，但是含有网具没有捕获的种类[35]；Zhang等(2019)使用该技术调查了长江口区域不同季节的鱼类组成，共鉴定出41个种类，虽然鉴定出的种类数量较多，但是缺乏与网具采样效果的对比[36]。这些研究说明环境DNA技术的监测效果在不同类型的水体中有所差别，在一些水域能够较好地代替传统的调查方法，而在另一些水域只能作为补充手段，这可能与这些水体的环境特征有关，其适用性需要针对具体的调查水域进行进一步的评估。

2.3 资源量调查

对目标生物的资源丰度进行调查是水生生物资源监测的重要内容，传统上依赖网具和声学手段进行。Ficetola等发现了牛蛙密度高的池塘中所提取的DNA扩增率明显高于低密度的池塘，这为使用环境DNA技术监测资源丰度提供了启示[12]。近十几年来，不断有学者尝试利用环境DNA技术在不同水域对多种生物进行调查研究[37-38]。这些研究结果表明动物密度与其环境DNA浓度之间存在某种非线性关系，可以通过测量一个样本中环境DNA拷贝的数量来估算物种生物量[39]。常见的方法为在实验室条件下饲养目标物种，再检测水样中的环境DNA浓度，由此绘制种群密度与环境DNA浓度关系的标准曲线，在此基础上采集监测水域中的水样并测量环境DNA浓度，通过对比标准曲线就可推算监测物种的密度和分布[40]。然而，这种方法只适合于水样中环境DNA浓度与该物种数量的相关性较强的物种，对于带有坚硬外壳的虾类或者贝类的物种，其环境DNA浓度与生物量之间的关系并不明显[41-42]。

由于技术等诸多因素的限制，单独依靠环境DNA技术对资源量进行调查仍有较大不确定性，相关技术的改进一直处于探索之中，Doi等(2015)发现微滴式数字PCR (Droplet Digital PCR, ddPCR)比qPCR更适合于测定水中环境DNA的浓度[43]；Takahala等(2012)尝试了使用不同孔径的滤膜来进行检测，并对比出了更适合当地鲤鱼(Cyprinuscarpio)的滤膜孔径，并成功使用环境DNA技术对当地的鲤鱼群落进行了监测[44]；卢珊等(2015)发现酒精多次沉淀法浓缩的水样可获得最佳的环境DNA提取效果[45]。目前，环境DNA技术常配合其他方法共同调查资源量，如在Sigsgaard等(2015)的研究中，将环境DNA技术结合潜水员观察，发现环境DNA技术的结果与潜水观测的结果呈现高度一致性[37]。在长江流域，吴昀晟等(2019)使用该技术通过多项式估算了长江江苏段的江豚数量，但估算缺乏与实际观测数量的对比验证[21]。除了江豚以外，在长江流域还未有更多的利用环境DNA技术调查物种丰度的报道出现，因此该应用方向也具有广阔的探索空间。

2.4 遗传多样性

遗传多样性一般所指的是种内的遗传多样性，即种内个体之间或一个群体内不同个体的遗传变异总和。使用环境DNA技术分析遗传多样性的原理是检测样品中同一种群中每个个体之间的DNA差异来分析其遗传变异。Sigsgaard等(2016)使用环境DNA技术对阿拉伯海湾鲸鲨(Rhincodontypus)的遗传多样性进行了分析，得到了其种群数量及结构[46]；Tsuji等(2020)使用该技术发现能从低浓度且含有外来物质的样本中识别出香鱼(Plecoglossusaltivelis)个体的差异，虽与传统捕获方法相比能明显检测到更多个体，但是也没有覆盖该种群的全部遗传多样性[47]。因此，尽管基于环境DNA的方法仍有一定的局限性和误判风险，但具备作为调查野外物种遗传多样性有效方法的潜力。

3 影响因素与局限性

3.1 自然因素

根据目前的研究，对环境DNA降解的速率影响较大的环境因子有pH值、温度、光照、流速、水深等。Seymour等(2018)发现，一般情况下酸性环境加快了环境DNA的降解速度，环境DNA在碱性和中性条件下的降解速度几乎没有差异[48]；另外，高温也被认为会加速环境DNA的降解，且光照常与高温相伴随，因此也常被认为会加速环境DNA的降解，但也有特殊情况，如Andruszkiewicz等(2017)发现温度对日本鲭(Scomberjaponicus)的环境DNA降解几乎没有影响，光照也不是导致其环境DNA衰退的主要原因[49]。

虽然近年来科学界对于环境因子影响环境DNA鉴定结果准确性的研究在不断进行，但是由于对影响环境DNA的物理和化学因素，以及对环境DNA降解和转运过程的了解仍然有限，因此还是很难获知监测对象存在的精确时间、距离和数量。

3.2 外界污染

环境DNA样品在每一个操作过程中都可能发生污染，即混入来自非目标水样的DNA。由于环境DNA技术的灵敏性，少许的污染就会对最终的结果造成巨大的误差。因此在调查前必须采取严格的控制措施，包括对采样工具、设备进行灭菌处理[37]；在操作过程中始终佩戴一次性无菌手套并及时更换[13]；每个采样点增加阴性对照组，即过滤蒸馏水或无目标生物生存区域的水样，也有助于验证实验过程中有无污染[24]；每个采样点的样品隔离保存，防止交叉污染。

3.3 技术因素

环境DNA的操作流程分为环境DNA的获取、提取和鉴定等步骤[50]，其中最常影响结果的环节就是环境DNA的鉴定。这是因为在环境DNA的鉴定过程中，目前常用到的PCR技术具有偏向性，因此PCR结果的DNA比例并不一定等同于被监测生物群体的比例[51]，从而造成误差。为解决PCR技术带来的误差，可以在测序时使用单分子测序技术[52]，该技术不需要使用PCR扩增，可以解决目前测序中所存在的偏向性问题。另一方面，在环境DNA的鉴定过程中，常使用到DNA条形码技术(DNA Barcoding)，但由于其分辨率较低，有时无法区分检索序列匹配程度相同的物种[53]，因此，相同的序列可能代表不同的物种，Wilcox等(2013)通过对美洲红点鲑(Salvelinusfontinalis)和强壮结点鲑(S.confluentus)的检测，发现在基因型相似的情况下，种间特异性不足可导致假阳性和假阴性结果[54]。徐念等对长江中下游干流环境DNA样本进行监测时，鱼类物种中的鲤及其部分亚种分别与检索序列匹配程度相同而导致无法区分[35]。

4 环境DNA技术在长江口水生生物监测中应用的建议

长江口水域的水生生物资源监测中根据项目目标的不同具有多种的监测需求。在监测特定物种方面，除了江豚和中华鲟，长江口水域还栖息着松江鲈、花鳗鲡(Anguillamarmorata)、胭脂鱼(Myxocyprinusasiaticus)等诸多珍稀濒危物种[55]，它们数量稀少，或在洄游过程中季节性地出现在河口水域[56-59]，因此在长江口的重点水域开展常规性的环境DNA调查，以监测珍稀濒危物种的出现和分布，可能具有极大的应用潜力。在监测珍稀物种时，也可以同时监测其遗传多样性，分析其种群结构与个体状态，从而有利于更好地对其制定保护措施。另外，上海作为远洋船舶密集分布的国际航运中心，对于水体中外来种或入侵种扩散趋势的监测具有强烈需求，因此环境DNA技术还可以成为长江口水域生态安全监测体系的重要组成部分。

长江口生物多样性的监测一直是该区域监测工作的重点，渔获物分析作为传统监测体系的重要信息源[60]，可以预见在长江流域长期禁渔的背景下将会受到限制，增加环境DNA技术可能有助于补充监测手段和信息来源，构建更加多元的监测体系。但是，长江口区域的地形、水文条件复杂多变，环境DNA技术与传统方法的监测效果的优劣需要进行比较研究。譬如，长江口沿岸碎波带是诸多暖水性鱼类仔稚鱼的保育场，因此是生物多样性监测的重点区域，但碎波带区域大多地势低平，部分岸段滩窄坡陡，底质由泥沙堆积而成，结构松散，易受侵蚀，导致其水流中泥沙含量较高，在过滤时会阻塞滤膜孔，从而可能影响环境DNA结果的准确性[61-63]，可以使用多层纱布进行预过滤以防止滤膜阻塞，提高检出率[21]。

在经济鱼类资源量调查方面，长江口水域作为我国重要的传统渔场，是多种经济鱼种如刀鲚(Coilianasus)[64]、凤鲚(Coiliamystus)[65]和棘头梅童鱼(Collichthyslucidus)[66]的良好索饵场，相关资源量的波动是常规性的监测内容，虽然目前在长江流域应用环境DNA技术进行生物量监测的案例很少，但是特定物种环境DNA浓度在时间尺度上的相对变化是一个值得尝试的研究内容和应用探索。另外，对于鱼卵与仔稚鱼的资源补充量监测，都存在使用环境DNA技术补充传统调查手段的应用潜力。