Ki-67增殖指数在初治可切除胃癌预后中的价值

廖承磊，刘立恒，王子卫

(重庆医科大学附属第一医院胃肠外科 400010)

胃癌是世界上五大恶性肿瘤之一，并且是第三大癌症致死原因[1]。在我国也是最常见的恶性肿瘤之一。由于人口老龄化及传统生活方式改变等原因，未来胃癌发病率将显著上升[2]。虽然手术切除仍然是初治可切除胃癌最有效的治疗方式，但近一半的患者在手术切除后复发并发展成为晚期胃癌[3]，致使患者的5年总体生存率相对较低[4]。目前TNM分期系统仍然是评估胃癌患者预后最重要的工具，但是在初治可切除胃癌患者当中，即使是相同TNM分期的患者，接受了根治性切除手术后，也会表现出不同的临床结局。因此，急需寻找新的工具去预测初治可切除胃癌的生存。

Ki-67是一种核DNA结合蛋白，存在于细胞周期的G1、S、G2和M期，而在静止的G0期细胞中不表达。近年来，Ki-67增殖指数被广泛用于评估肿瘤细胞的增殖能力。除此之外，Ki-67增殖指数与多种肿瘤的无病生存期(DFS)及总体生存期(OS)呈显著负相关。在乳腺癌中，Ki-67增殖指数是影响DFS及OS的独立危险因素[5-6]。同样，1项回顾性研究表明，早期胃癌中，Ki-67高表达与预后不良有关[7]。然而，Ki-67对预后的判断作用仍有争议，有学者认为Ki-67增殖指数并不能预测胃癌患者的临床结局[8]；有的甚至认为，低Ki-67表达水平患者，预后反而更差[9]。本研究旨在评估Ki-67增殖指数在胃癌预后中的预测价值，进而指导临床治疗及患者分层。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2013年12月至2014年11月就诊于本院胃肠外科并确诊为胃癌的患者。纳入标准：(1)患者年龄18～80岁。(2)经手术根治术后病理检测结果为腺癌。(3)患者病例资料齐全，包括：年龄、性别、联系方式、手术方式、术后病理资料，其中病理资料需包括Ki-67增殖指数。(4)患者术后均进行辅助化疗，化疗方案以氟尿嘧啶衍生物替吉奥为基础，连续口服给药14 d，休息7 d，或联合静脉给药奥沙利铂、多西他赛、伊立替康；或者以奥沙利铂为基础第1天静脉化疗，联合伊立替康或多西他赛；药物剂量均以体表面积计算。排除标准：(1)术前新辅助放化疗者；(2)术前已经发生影像学能证实的远处转移，不能行根治性切除者，包括肝、肺、卵巢等；(3)大量腹水或恶病质的患者；(4)严重的心血管系统、呼吸系统、肝脏、肾脏疾病，精神病，糖尿病患者；(5)病理类型混合有神经内分泌癌及其他病理类型者。共纳入90例患者，对所有患者进行电话随访，随访时间将手术时间作为起始时间，截止时间为2019年11月30日，根据美国抗癌协会和国际抗癌联盟(AJCC/UICC)第8版TNM分期进行分期，预后评价指标为患者5年总体生存率。

1.2 方法

1.2.1主要试剂

鼠抗人Ki-67、人类表皮生长因子受体2(Her-2)、血管内皮生长因子(VEGF)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)单克隆抗体，免疫组织化学Max Vision 试剂盒和二氨基苯联胺(DAB)试剂盒均购自福州迈新生物技术开发有限公司。

1.2.2免疫组织化学

标本经 10%甲醛固定，石蜡包埋，5 μm厚度切片，脱蜡水化后，3%过氧化氢灭活内源性过氧化物酶15 min,磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗3 min×3次；高温高压组织抗原修复(柠檬酸盐缓冲液95 ℃ 浸泡反应10 min)，PBS漂洗3 min×3次；滴加一抗(以PBS取代一抗作阴性对照)，4 ℃冰箱过夜，取出PBS漂洗3 min×3次；滴加多聚酶标二抗室温孵育15 min,PBS漂洗3 min×3次；DAB显色3 min；流水清洗，苏木素复染，脱水、透明、中性树胶封片,光镜观察结果，由重庆医科大学病理中心进行分析，以已知的Ki-67、Her-2、VEGF、VEGFR阳性的胃癌切片作阳性对照。

1.2.3结果判定

每张切片选择 10 个高倍视野，每个视野观察100个肿瘤细胞，计算平均阳性细胞比例为该肿瘤的阳性细胞百分比。Ki-67在细胞核内呈现为棕黄色颗粒为显色，Her-2、VEGF、VEGFR以细胞膜或细胞质内出现棕黄色颗粒为显色，染色肿瘤细胞大于或等于10%为阳性。

1.3 统计学处理

采用SPSS25.0软件对数据进行统计学处理。采用描述性统计学方法对患者临床病理特征分布情况进行统计，非正态分布的计量资料用中位数和四分位间距[M(P25,P75)]表示，Mann-WhitneyU检验进行Ki-67增殖指数及临床病理参数比较。Kaplan-Meier生存分析及Cox风险回归模型单因素及多因素分析研究各临床病理特征与预后的关系，log-rank检验曲线间差异。采用logistic回归进行单独病理分期、Ki-67联合病理分期及Ki-67联合病理分期及分化程度的生存分析并获得其预测概率。利用概率值制作受试者工作特征(ROC)曲线评价病理分期、Ki-67联合病理分期，以及Ki-67联合病理分期及分化程度对预后的判断价值。检验水准α=0.05，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 一般资料

90例患者中，男76例(84.44%)，女14例(15.56%)。45例(50.00%)患者年龄大于或等于60岁，45例(50.00%)患者年龄小于60岁。63例(70.00%)患者为低分化，22例(24.44%)患者为中高分化，5例(5.56%)患者病理检测结果未报告分化程度。30例(33.33%)患者为T1/T2期，60例(66.67%)患者为T3/T4期。35例(38.89%)患者未见淋巴结转移，55例(61.11%)患者有淋巴结转移。21例(23.33%)患者Ⅰ期，69例(76.67%)患者Ⅱ/Ⅲ期。Her-2阳性52例(57.78%)，Her-2阴性37例(41.11%)，1例(1.11%)患者病理未报告Her-2表达情况。41例(45.56%)患者VEGF/VEGFR表达阳性，39例(43.33%)患者VEGF/VEGFR表达阴性，10例(11.11%)患者未报告VEGF/VEGFR表达情况，见表1。Ki-67、Her-2、VEGF、VEGFR染色见图1。

表1 Ki-67增殖指数与临床病理特征的相关性比较(n=90)

续表1 Ki-67增殖指数与临床病理特征的相关性比较(n=90)

2.2 Ki-67增殖指数与临床病理参数的相关性

结果显示，Ki-67增殖指数与患者性别、浸润深度、淋巴结转移、病理分期、Her-2表达状态、VEGF/VEGFR表达状态无关(P>0.05)。但是，年龄大于或等于60岁患者的Ki-67增殖指数明显高于年龄小于60岁患者，差异有统计学意义(Z=2.156,P=0.031)，且低分化胃癌患者Ki-67增殖指数明显低于中高分化胃癌患者，差异有统计学意义(Z=-2.634,P=0.008)，见表1。

2.3 各临床病理参数与5年总体生存率的Kaplan Meier分析

为了进一步研究Ki-67增殖指数及临床病理因素与患者预后的关系，笔者进行了Kaplan-Meier生存分析，结果显示，患者的性别、年龄与5年总体生存率无关(P>0.05)。而低分化、T3/T4分期、N+期、病理分期Ⅱ/Ⅲ期患者的5年总体生存率明显低于中高分化、T1/T2分期、N0期、病理分期Ⅰ期患者，差异均有统计学意义(P=0.012、0.013、0.008、0.006)，见表2。值得注意的是，Ki-67增殖指数小于30%的患者5年总体生存率明显低于Ki-67增殖指数大于或等于30%的患者，5年总体生存率分别为35.29%、71.23%，差异有统计学意义(P=0.003)。生存曲线见图2。

A：Ki-67 HE染色(50×)；B：Ki-67免疫组织化学阳性(100×)；C：Ki-67免疫组织化学阳性(400×)；D：Her-2 HE染色(50×)；E：Her-2免疫组织化学阳性(100×)；F：Her-2免疫组织化学阳性(400×)；G：VEGF HE染色(50×)；H：VEGF免疫组织化学阳性(100×)；I：VEGF免疫组织化学阳性(400×)；J：VEGFR HE染色(50×)；K：VEGFR免疫组织化学阳性(100×)；L：VEGFR免疫组织化学阳性(400×)。

表2 临床病理参数与5年总体生存率的Kaplan Meier分析

续表2 临床病理参数与5年总体生存率的Kaplan Meier分析

A：分化程度;B:T分期;C:N分期;D:病理分期;E:Ki-67增殖指数。

2.4 各临床病理参数与5年总体生存率的单因素Cox回归分析

为了验证Ki-67增殖指数及各临床病理因素与患者预后的关系，笔者进行了单因素Cox回归分析。结果显示，分化程度、T分期、N分期、病理分期及Ki-67增殖指数是胃癌患者5年总体生存率的影响因素，差异有统计学意义(HR=4.073,P=0.021;HR=3.135,P=0.019;HR=2.940,P=0.011;HR=5.833,P=0.016;HR=2.885,P=0.005)，性别、年龄、Her-2表达状态、VEGF/VEGFR表达状态与患者5年总体生存率无明显相关性(P=0.428、0.716、0.171、0.285)。见表3。

表3 临床病理参数与5年总体生存率的单因素Cox回归分析

续表3 临床病理参数与5年总体生存率的单因素Cox回归分析

2.5 各临床病理参数与预后的多因素的Cox回归分析

将上述指标进一步纳入多因素Cox回归分析，平衡分化程度、浸润深度及淋巴结转移的影响后，结果表明，病理分期及Ki-67增殖指数是患者5年总体生存率的独立危险因素，差异有统计学意义(HR=5.114,P=0.026;HR=2.746,P=0.010),见表4。

表4 临床病理参数与5年总体生存率的多因素Cox回归分析

续表4 临床病理参数与5年总体生存率的多因素Cox回归分析

2.6 ROC曲线分析3种模型对患者生存的预测能力

为了提高AJCC/UICC第8版TNM分期在判断胃癌患者生存率的能力，笔者以Ki-67增殖指数30%为临界点将胃癌患者分成高低两组，并按病理分期分为Ⅰ期及Ⅱ/Ⅲ期两组，按分化程度分为低分化及中高分化两组，利用二元logistic回归计算病理分期模型及Ki-67增殖指数联合病理分期模型、Ki-67增殖指数联合病理分期及分化程度模型预测患者的生存能力，并利用预测概率制作3种情况下的ROC曲线，并计算ROC曲线下面积(area under curve，AUC)。结果显示，病理分期模型的AUC为0.636(P=0.032)，灵敏度和特异度分别为0.939、0.667，临界值为0.272 2；Ki-67增殖指数联合病理分期模型的AUC为0.716(P=0.001)，灵敏度和特异度分别为0.970、0.719，临界值为0.155 7；而Ki-67增殖指数联合病理分期及分化程度模型的AUC为0.778(P<0.001)，灵敏度和特异度分别为0.967、0.709，临界值为0.119 8。可见，Ki-67联合病理分期及分化程度模型明显优于其他两种模型的预测能力。见图3。

A：病理分期模型的ROC曲线；B：Ki-67联合病理分期模型的ROC曲线；C：Ki-67联合病理分期及分化程度模型的ROC曲线。

3 讨 论

Ki-67作为一种核DNA结合蛋白，参与了有丝分裂时期染色体外表面蛋白外壳的形成，在染色体表面作为一种表面激活剂促进有丝分裂的进行[10]，似乎Ki-67高的肿瘤细胞具有更差的表型及更强的侵袭性，而本研究得出低Ki-67增殖指数的胃癌细胞倾向于低分化，可能与Ki-67抑制细胞分裂期间染色体的聚集有关[11-12]，低Ki-67增殖指数对于染色体聚集的抑制作用弱。而异染色体的形成与SMAD4基因表达呈现负相关的关系[13]。SMAD4是一种抑癌基因，它在多种肿瘤中表现出表达缺失，包括胃腺癌[14]。低Ki-67增殖指数促进异染色质的形成，下调了SMAD4基因的表达，从而促进胃癌的进展，使得胃癌细胞向低分化发展，进而缩短患者的生存时间。同时，端粒是一种特殊的异染色体结构，研究显示[15]，中高分化的胃癌细胞端粒长度明显长于低分化的胃癌细胞，并且，淋巴结转移的胃癌细胞端粒长度明显短于未发生淋巴结转移的胃癌细胞，提示端粒缩短会促进胃癌细胞的进展，这进一步提示低Ki-67的胃癌细胞不能阻止端粒缩短，致使胃癌细胞低分化。综上所述，低Ki-67增殖指数的胃癌细胞向低分化发展，导致患者预后更差。

目前，已经发现许多与胃癌增殖、分化、转移相关的生物标志物，如EGRF、VEGF、Her-2、Ki-67。本研究表明，Ki-67增殖指数与VEGF/VEGFR、Her-2的表达并不存在相关性，VEGF/VEGFR、Her-2的阳性表达也与胃癌患者预后无关。Ki-67增殖指数被报道与多种肿瘤的预后相关，比如胃癌、结肠癌、乳腺癌，大多数倾向于高Ki-67增殖指数的患者预后更差[6，16]。笔者以30%为截断值将胃癌患者进行分组，结果显示，低Ki-67增殖指数的患者的预后明显更差，Ki-67增殖指数小于30%及大于或等于30%的患者5年总体生存率分别为35.29%、71.23%，两组生存曲线有明显差异(P=0.003)。这也是国内率先报道高Ki-67增殖指数的胃癌患者5年总体生存率更长。低Ki-67增殖指数患者的5年总体生存率更短，反映了在非转移胃癌患者当中，低Ki-67表达的癌细胞具有低增殖能力及高侵袭性的特点。

大量研究表明，增殖能力强的肿瘤细胞对化疗敏感性好。1项前瞻性研究表明[17]，Ki-67增殖指数大于35%的乳腺癌新辅助化疗患者的化疗反应性更好，在病理完全缓解组的Ki-67增殖指数平均水平显著高于未获得病理完全缓解组。1项meta分析[18]显示，在接受新辅助化疗的乳腺癌患者中，高表达Ki-67组比低表达Ki-67组有更高的病理完全缓解率。因此，本研究中，低Ki-67增殖指数组患者5年总体生存率低可能与胃癌细胞低增值率对化疗不敏感有关。所以，Ki-67增殖指数预测胃癌患者新辅助或辅助化疗效果可能具有相当大的价值。为此，迫切需要一个多中心前瞻性研究，以探究Ki-67增殖指数与胃癌患者化疗的关系。

TNM分期目前仍然是使用最为广泛的对胃癌患者进行分层及指导治疗的工具，而分期越晚，患者的OS或PFS越短是业界所公认的事实[19]。本研究也表明，在可切除胃癌患者当中，Ⅱ/Ⅲ期患者5年总体生存率明显低于Ⅰ期患者。但是，不同的患者，即使是TNM分期相同，经过相同的治疗后，也可能会获得不同的生存期，TNM分期系统的不足日益展现，对TNM分期系统进行补充是必然的趋势。笔者发现联合Ki-67增殖指数、病理分期及分化程度要比单独使用病理分期能更准确地评估患者生存结局。Ki-67增殖指数作为术后病理检测常规项目之一，可以作为对TNM分期系统的一种补充，帮助更准确地预测初治可切除胃癌患者术后5年生存情况，这样有助于进一步对患者进行分层，指导后续治疗方案的选择。

本研究也存在一定的不足，Ki-67增殖指数判定可能被各种因素影响，如不同的免疫组织化学方法，不同的抗体选择，计数病变区域的方法和病理医师判断标准等。

综上所述，本研究表明，Ki-67增殖指数高与初治可切除胃癌5年总体生存率升高有关。笔者认为，这一发现可以帮助预测临床结果和定义预后不良的患者亚组，并可用于选择更有可能受益于辅助化疗的患者。