基于网络药理学探讨桑寄生“补肝肾、强筋骨”的作用机制

李小芬 方镕泽 冯 华 王祥培*

1.成都中医药大学药学院，四川 成都 611130；2.贵州中医药大学药学院，贵州 贵阳 550025；3.遵义市食品药品检验所，贵州 遵义 563002

桑寄生为桑寄生科植物桑寄生Taxilluschinensis(DC.)Danser的干燥带叶茎枝，具有祛风湿、补肝肾、强筋骨、安胎元等功效，用于风湿痹痛，腰膝酸软、筋骨无力、崩漏经多、妊娠漏血、胎动不安、头晕目眩等症[1]。桑寄生始载于《神农本草经》，被列为上品，是临床常用的祛风湿药，而其补肝肾、强筋骨、安胎等作用在临床上应用也非常广泛，已经被历代的医家在实践中证实[2-4]。现代研究发现，古典理论认为的“肝藏血”“肾藏精”以及“肝主筋”“肾主骨”与现代医学研究能够完全契合，为临床运用“补肝肾、强筋骨”法则治疗筋骨疾病提供了可靠依据[5]。肾气旺盛，肾精充足，骨骼则健壮，骨髓生化有源，四肢百骸功能正常；肝血充盛，筋骨得到充沛的濡养，才能强健有力。因此，临床上补肝肾、强筋骨是骨质病变的主要治法之一[6]。桑寄生主要含黄酮类、生物碱、萜类、多糖、蛋白质等化学成分，其中黄酮类成分为主要活性成分[7-9]。研究[9]发现，桑寄生水煎液可抑制骨吸收，提高骨质量，改善骨代谢的负平衡状态，从而达到治疗骨质疏松的作用。体外研究[10]表明，黄酮类物质可通过抑制破骨细胞分化，促进骨形成，起到抗骨质疏松的作用。目前，有关桑寄生“补肝肾、强筋骨”的药效研究已有报道[9,11]，但从细胞及分子水平系统全面的揭示桑寄生以何种途径发挥“补肝肾、强筋骨”作用的分子机制鲜见报道，亟待进一步加强。

传统中医药(理、法、方、药)由于缺乏分子生物学的表征，无法发挥其独特的优势，难以与现代科学有机的融合[12]。近年来，随着网络药理学的兴起，它主要是通过构建和整合“成分-靶标-通路-疾病”多层次网络，分析特定信号节点之间的相互作用关系，从系统、整体角度探索药物与机体相互作用的一门新学科[13-14]。网络药理学被认为是一种提高新药临床试验的成功率，节省药物研发费用的新方法，尤其有助于阐明多组分和多靶标之间潜在的复杂关系，而其整体性、系统性的特点更是与中药“多成分、多途径、多靶点”协同作用的特点不谋而合，为中医药复杂系统的研究提供了新的思路[15-16]。因此，本文采用网络药理学的方法，通过数据挖掘、筛选、构建桑寄生“补肝肾、强筋骨”作用的“中药-活性成分-核心靶点-疾病”网络，探讨桑寄生“补肝肾、强筋骨”的作用机制，以期为桑寄生传统功效作用机制的阐释提供参考依据。技术路线如图1所示。

1 方法

1.1 化学成分的收集 通过查阅《中华本草》、 中国知网(CNKI, http://kns.cnki.net/kns/brief/default_result.aspx)、PubMed数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)、中医药综合数据库TCMID (http://www.megabionet.org/tcmid/)和中药系统药理学分析平台(TCMSP, http://lsp.nwu. edu.cn/tcmsp.php)，搜索桑寄生所有化学成分。

1.2 活性成分的筛选 口服生物利用度(oral bioavailability，OB) 是评估药物能否开发的关键参数，也是评价中药临床疗效的有效指标。类药性( drug likeness，DL) 目前被广泛用于评价先导化合物药物是否有可能成药的重要依据。在TCMSP 数据库中认为 OB>30%的分子具有较好的口服生物利用度，DL>0.18的分子具有较好的类药性[17]。将桑寄生所有化学成分，以ADME(吸收、分布、代谢、排泄)参数(OB≥30%和 DL≥0.18)或生物活性(文献已有报道)为标准，筛选桑寄生的活性化学成分。然后通过PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)搜索活性化学成分的结构式。

1.3 药物靶点与疾病靶点的建立 通过TCMSP数据库和Swiss TargetPrediction(http://www.swissta rgetprediction.ch/)数据库，检索桑寄生活性化合物对应的靶点，建立活性成分靶点数据集。通过人类基因和基因表型综合数据库(OMIM，http://www.omim.org/)和GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)以“Bone weakness”“waist and knee pain”“Liver and kidney deficiency”和“Osteoporosis”为关键词检索“补肝肾、强筋骨”相关的靶点，建立疾病靶点数据集。最后将筛选得到的所有靶点均经UniProt数据库(https://www.uniprot.org/)查询转化成UniProt ID格式。

1.4 核心靶点的筛选及网络的构建 将药物靶点与疾病靶点进行取交集，存在交集中的靶点即为桑寄生“补肝肾、强筋骨”的预测靶点。将其导入String数据库(https://string-db.org/)中构建“药物-疾病”交集靶点PPI网络，并采用cytoscape 3.6.1 软件对PPI网络进行可视化分析，以网络中每个节点的拓扑参数“节点连接度”(Degree)、“节点介度”(Betweenness centrality)、“节点紧密度”(Closeness centrality)的中位数为卡值，选取同时满足大于3个卡值的节点，作为桑寄生“补肝肾、强筋骨”的核心靶点；同时采用cytoscape 3.6.1 软件构建“中药-活性成分-核心靶点-疾病”网络。

1.5 生物过程分析 将核心靶点输入Cytoscape3.6.1软件的ClueGO插件中进行基因本体(GO)生物学过程和基于京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析，以P≤0. 01作为筛选标准，筛选出具有极显著性差异的生物过程和信号通路。

1.6 构建桑寄生“补肝肾、强筋骨”作用的通路图 运用KEGG (https://www.genome.jp/kegg/)数据库中的KEGG Mapper功能，将核心靶点映射在相关信号通路上，揭示桑寄生多靶点、多途径的治疗作用。

2 结果

2.1 桑寄生活性成分的筛选 从《中华本草》、中国知网、PubMed数据库、TCMSP数据库和TCMID数据库中得到目前桑寄生已报道的58个化学成分，根据ADME参数(OB≥30%和 DL≥0.18)或生物活性(文献已有报道)为标准，共筛选得到8个桑寄生活性化合物，并下载其结构式，结果见表1。

表1 桑寄生活性化合物的相关参数及结构式

表1 桑寄生活性化合物的相关参数及结构式

2.2 桑寄生活性成分靶点预测 将 TCMSP、Swiss TargetPrediction数据库检索得到的所有靶点，删除重复靶点，最终得到8个活性成分对应的靶点，共计358，结果见表1。在OMIM和GeneCards数据库以“Bone weakness”“waist and knee pain”“Liver and kidney deficiency”和“Osteoporosis”为关键词检索整合得到1535个“补肝肾、强筋骨”相关的疾病靶点。最后将筛选得到的所有靶点均经UniProt数据库查询转化成UniProt ID格式。

2.3 桑寄生核心靶点的筛选 将药物靶点与疾病靶点进行取交集，得到88个交集靶点，并绘制韦恩图，结果如图2所示。将交集靶点输入String数据库(https://string-db.org/)中构建PPI网络，并采用cytoscape 3.6.1 软件对PPI网络进行可视化分析，得到所有节点3个拓扑参数的中位数值分别为15(Degree)、0.0042(Betweenness centrality)、0.5119(Closeness centrality)，选取同时满足大于3个拓扑参数中位数值的节点，作为桑寄生“补肝肾、强筋骨”的核心靶点，结果见表2；同时采用cytoscape 3.6.1 软件构建“核心靶点”PPI网络，结果如图3所示。

表2 桑寄生“补肝肾、强筋骨”核心靶点的相关拓扑参数

表2 桑寄生“补肝肾、强筋骨”核心靶点的相关拓扑参数

2.4 桑寄生“补肝肾、强筋骨”核心靶点网络构建 通过cytoscape 3.6.1 软件分别构建“中药-活性成分”网络、“活性成分-靶点”网络、“疾病-靶点”网络，将以上网络合并成为一个网络，最终构建“中药-活性成分-核心靶点-疾病”网络，结果如图4所示。

2.5 GO生物过程富集分析 将33个核心靶点输入Cytoscape 3.6.1软件的ClueGO插件中进行GO生物过程富集分析，保留P≤0.01的结果，进行可视化分析，结果如图5所示。结果共富集得到 68个生物过程，根据Term P-value越小，Term可靠性越高的原则，列举了排名前20的生物过程，结果如图6所示。结果表明桑寄生“补肝肾、强筋骨”的作用主要可能是通过调控胶质细胞分化，活性氧生物合成过程，对生长激素的反应，胰岛素样生长因子受体信号通路，肽基酪氨酸自磷酸等多个生物过程而起到治疗功效，体现了中药多途径的治疗作用。

2.6 KEGG通路富集分析 将33个核心靶点输入Cytoscape 3.6.1软件的ClueGO插件中进行KEGG通路富集分析，保留P≤0.01的结果，进行可视化分析，构建“靶点-通路”网络，结果如图7所示。根据核心基因在通路中占的个数越多，信号通路越重要，列举了排名前20的信号通路，结果见表3。结果共富集得到 59条信号通路，其中主要的信号通路包括NF-κB信号通路，长寿调节途径，破骨细胞分化，C型凝集素受体信号通路，JAK-STAT信号通路，雌激素信号通路，催乳素信号通路，甲状腺激素信号通路，松弛素信号通路等，提示桑寄生“补肝肾、强筋骨”的作用可能是以上多条信号通路参与的结果。

表3 桑寄生“补肝肾、强筋骨”排名前20的信号通路富集结果

表3 桑寄生“补肝肾、强筋骨”排名前20的信号通路富集结果

2.7 桑寄生“补肝肾、强筋骨”作用的通路注释图 将33个核心靶点输入KEGG数据库的KEGG Mapper功能中，标注出核心靶点在每条相关信号通路中所占的个数。结果显示有8个靶点蛋白参与雌激素信号通路的相关调控，揭示桑寄生多靶点、多途径的治疗作用，结果如图8所示。

3 讨论

桑寄生强筋骨的作用被历代医家所认可，现代医学研究认为肝脏是多种营养物质代谢的中枢，也是人体维生素、激素等代谢的场所，这就是中医理论所说的“肝藏血”。肾脏影响维生素D的形成及控制钙、磷等元素的代谢，这就是中医理论所说“肾主骨生髓”的作用。中医理论认为“肝主筋”“肾主骨”“肝肾同源”与现代医学研究能够完全契合，而其强筋骨作用与补肝肾作用密切相连，是补肝肾作用的体现和应用[5,18]。郑磊等[6]从“肝主筋”“肾主骨”“肝肾同源”3个方面探讨了“补肝肾、强筋骨”的作用机制，结果表明其主要与肝脏能量代谢、核酸代谢，肾脏影响维生素D的形成、激素、钙、磷代谢等生理过程相关，为“补肝肾、强筋骨”的现代研究提供了可靠依据。

本研究预测出桑寄生主要有效成分为槲皮苷、槲皮素、没食子酸、维生素C、萹蓄甘、β-谷甾醇等，主要为黄酮类成分。研究[19]表明，萹蓄苷、槲皮苷为桑寄生补肝肾、强筋骨功效的代表性成分。桑寄生中槲皮素可诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞的增殖、迁移和新生血管生成[20]，槲皮苷具有抑制乙酰胆碱酶和苏氨酸激酶等作用[21]。研究[22]发现桑寄生叶子中富含丰富的维生素C，维生素C具有强烈的生理活性，参与人体多种代谢，是人体必需的维生素之一，具有解毒和改善肝功能、保持肌肤润滑、清除自由基、保护心脏及血管、抗肿瘤等作用。网络药理学分析结果表明，AKT1、SRC、EGFR、TNF、JUN、PTGS2、ESR1可能为桑寄生“补肝肾、强筋骨”的潜在靶点。AKT1是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 ，该蛋白参与多种生物学过程，包括代谢，增殖，细胞存活，生长和血管生成等，均是通过一系列下游底物的丝氨酸/苏氨酸磷酸化来介导的。AKT激活依赖于PI3K途径，并被认为是该途径中的关键节点。乌头汤可改善膝骨关节炎大鼠关节软骨的形态结构，抑制关节软骨中与炎症相关信号转导通路的激活，下调p38 MAPK、JNK、Ras、ERK、iNOS 蛋白含量表达，发挥保护关节软骨，延缓膝骨关节炎病理进程作用[23]。雌激素受体(estrogen receptor，ESR1)可延长破骨细胞的存活时间、减少其凋亡，抑制破骨细胞的活性和分化，最终达到抑制破骨细胞的骨吸收，防治骨质疏松的作用[24]。

GO生物过程富集分析，表明桑寄生“补肝肾、强筋骨”作用涉及细胞增殖、代谢过程、生物合成过程、炎症反应等生物过程，其中胶质细胞分化，活性氧生物合成过程，对生长激素的反应，胰岛素样生长因子受体信号通路，肽基酪氨酸自磷酸可能为桑寄生“补肝肾、强筋骨”作用的主要进程。KEGG通路富集分析，表明桑寄生主要是通过调控NF-κB信号通路，长寿调节途径，破骨细胞分化，C型凝集素受体信号通路，JAK-STAT信号通路，雌激素信号通路，催乳素信号通路，甲状腺激素信号通路，PI3K /AKT信号通路，MAPK 信号通路发挥“补肝肾、强筋骨”作用的。在PI3K /AKT 信号通路中，当AKT 及其靶基因激活时，可促进成骨细胞的分化，小鼠敲除 AKT1 和 AKT2 基因，会出现明显的骨量减少症状，提示成骨细胞可能通过 PI3K /AKT信号通路促进骨形成[25]。MAPK 信号通路是调控成骨细胞生长和分化的重要途径，研究[26]表明其主要包括ESR1通路，p38通路和JNK通路。ESR1信号通路能上调成骨细胞中Osterix mRNA的表达，抑制骨吸收，升高骨密度。

综上所述，本研究采用网络药理学的方法，构建“中药-有效成分-核心靶点-疾病”“靶点-通路”网络，发现桑寄生“补肝肾、强筋骨”的作用机制涉及多个生物过程、多条通路，体现了中药多成分-多靶点-多途径的作用特点。提示桑寄生“补肝肾、强筋骨” 的作用机制可能是以上靶点和信号通路共同作用的结果。但是具体的结果仍需要进一步的实验加以证明。