电化学方法检测血浆游离DNA甲基化水平与甲状腺癌诊断以及相关临床特征的关系

阚志文 黄子杰 崔亚云 钱立庭

1安徽医科大学附属省立医院放疗科（合肥230001）；2南方医科大学南方医院（广州510515）

甲状腺癌是最常见的恶性肿瘤，甲状腺癌远处转移及侵犯与预后密切相关［1-2］，所以甲状腺癌的早筛极为重要，当前的首选早筛方法为超声。目前，液体活检正受到医学界的关注，基于PCR 以及测序技术的cfDNA甲基化检测成为新的焦点［3-4］，其具有时间长、耗费高等缺点。SINA，Abu Ali Ibn，等人开发出一种基于电化学的检测方法，具有快捷灵敏廉价等优势，但没有进行甲状腺癌相关检测。本研究通过电化学方法对甲状腺癌、甲状腺良性病变与正常人血浆cfDNA 进行检测分析，在参照正常血浆cfDNA 基础上评估甲状腺良性病变、甲状腺癌的电流吸附率水平，初步探讨其在甲状腺癌中的诊断价值和效能以及与甲状腺结节TI-ADRS 分级、临床病理特征等关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料甲状腺结节患者纳入标准：（1）超声诊断甲状腺结节TI-RADS分级为2级以上；（2）初次就诊，此前未经手术。放化疗及生物治疗。排除标准：（1）甲状腺疾病治疗后的患者；（2）罹患其他类型癌症；（3）没有确切病理诊断的患者。正常人纳入标准：（1）没有患癌史；（2）体检无异常占位及结节病。最终纳入2019年3-7月于安徽省肿瘤医院的甲状腺结节患者149 例，其中甲状腺癌患者114 例，年龄（38.8 ± 13.4）岁；良性病变者35例，年龄（49.8±12.6）岁；来自中山大学肿瘤防治中心体检正常人血浆35 例作为对照组，年龄（36.9 ±10.1）岁。

1.2 实验材料

1.2.1 电化学工作站及电化学相关材料高通量全自动化核酸提取站（奥美泰克），电化学工作站（辰华chi660e），配备金电极，铂电极，银电极以及电极打磨机（Gaoss Union），亚铁氰化钾和铁氰化钾，超声清洗仪。

1.2.2 DNA提取相关试剂来自天根（tiangen）生化科技公司的DNA 提取试剂：Proteinase K，Buffer A，异丙醇-盐酸胍混合物，EB 洗脱液等。

1.3 方法收集所有患者的血浆样本，并提取血浆DNA，使用电化学方法测得每个患者的血浆cfDNA 电流吸附率水平，取样本血浆0.5 mL，利用高通量全自动化核酸提取站（奥美泰克）提取血浆cfDNA，置于磁力板上吸取上层cfDNA 清液35微升转入1.5 mL EP 管中，放入金电极10 min，电解池为超声打磨过铂电极，银电极，电解液为亚铁氰化钾和铁氰化钾溶液（200 mL 纯水，亚铁氰化钾0.211 g，亚铁氰化钾0.162 g），将铂电极、银电极及金电极放入电解池中分别连接电化学工作站，采用循环伏安法检测，氧化峰在0.2 V，基线电流取5.3 ～5.63e 之间，DNA 的吸附率计算公式为DNA电流吸附率=（基线电流-测量电流）∕基线电流×100%，测量三次取平均值（图1）。以病理结果为金标准，将被检测样品分为正常组（NC 组），甲状腺良性病变组（BC 组）和甲状腺癌组（TC 组），分别检测三组的吸附率并记录（图2）。根据甲状腺癌诊疗规范（2018 版）TI-DARS 分类，本批甲状腺癌根据超声将结节分为2 类、3 类、4a 类、4b 类、4c 类、5 类、6 类，观察不同分类结节DNA 电流吸附率情况。根据甲状腺癌诊疗规范（2018 版）将癌灶大小、淋巴结转移、局部侵犯、多中心性、TNM 分期等影响肿瘤预后的因素纳入统计学分析，观察与血浆DNA 电流吸附率关系。

图1 血浆cfDNA（游离DNA）电流吸附情况示意图Fig.1 Schematic diagram of plasma cfDNA（free DNA）current adsorption

图2 TC 组、BC 组及NC 组吸附率Fig.2 Adsorption rate of TC group，BC group and NC group

1.4 统计学方法使用SPSS 17.0 软件进行统计分析，以病理结果为金标准，计量资料采用（）表示。组间比较采用单因素方差分析，计数资料组间比较采用χ2检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。血浆cfDNA 电流吸附率水平诊断甲状腺癌的效能评价采用受试者工作特征（ROC）曲线分析；ir 值与TI-RADS 分级的检验采用秩和检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。ir 值与甲状腺癌多项病理特征采用χ2检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义；运用Logistic 回归分析对甲状腺癌血浆cfDNA电流吸附率水平等因素进行分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TC、BC、NC 组样本一般特征比较TC（甲状腺癌）组114 例，其中男28 例，女86 例，年龄为（38.8 ± 13.4）岁；BC（甲状腺良性病变）组35 例，其中男8 例，女27 例，年龄为（49.8 ± 12.6）岁：NC（正常对照）组35 例，其中男14 例，女21 例，年龄为（36.9 ± 10.1）岁，3 组性别差异无统计学意义（P＞0.05），年龄差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 DNA 电流吸附率对甲状腺癌的早期诊断具有一定的意义TC 组与NC 组ir值的ROC 曲线下面积为0.723，差异有统计学意义（P＜0.05）；TC与BC 组ir值的ROC 曲线下面积为0.778，差异有统计学意义（P＜0.05）；BC 与NC 组ir值的ROC 曲线下面积为0.384，差异无统计学意义（P=0.094），3 组检测灵敏度为61.4%，特异度为68.6%，准确度为64.1%，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图3-5。

图3 TC 组与NC 组ir 值诊断甲状腺癌的ROC 曲线Fig.3 ROC curve of thyroid cancer diagnosed by IR value in TC group and NC group

2.3 甲状腺癌组与良性结节组的TI-DARS 分级与吸附率情况比较以cutoff 值29 为界，将吸附率（ir）分为＜29 组和≥29 组，两组的TI-DARS 分级情况比较差异有统计学意义（P＜0.05）。ir 值≥29组TI-ADRS 分级4c、5级比例显著高于ir值＜29组；ir值＜29组TI-ADRS 分级3 级比例显著高于ir 值≥29 组，在4a、4b 级中，两组比例相差不大（表1）。

图4 TC 组与BC 组ir 值诊断甲状腺癌的ROC 曲线Fig.4 ROC curve of ir value in thyroid cancer diagnosis between TC group and BC group

图5 BC 组与NC 组ir 值的ROC 曲线Fig.5 ROC curve of ir value of BC group and NC group

2.4 甲状腺癌组中肿瘤临床病理特征与甲状腺癌吸附率情况分析以cutoff 值29 为界，将吸附率（ir%）分为＜29 组和≥29 组，在癌灶大小、淋巴结转移、局部侵犯、多中心性中的差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

2.5 关于甲状腺癌的Logistic 回归分析将ir 值（≥29=1，＜29=0）、年龄、性别（女=0，男=1）作为自变量，以甲状腺结节最终诊断为因变量（甲状腺癌=1，良性结节=0）进行Logistic 回归进行分析发现ir 值≥29 回归系数=0.257，OR= 1.293，ir 值≥29 是甲状腺癌的独立危险因素，ir 值越高，甲状腺癌风险越大（P＜0.01），见表3。

3 讨论

甲状腺癌多发于青壮年，早期无明显症状，大多表现为甲状腺结节，现有的早筛手段主要是超声，而在超声诊断的高危结节中，仍有很大一部分是良性病变，结构性检查（FNA）是甲状腺癌检查的金标准［5-7］，利用细针对甲状腺结节进行穿刺，从中获取细胞成分，通过细胞学诊断对目标病灶性质进行判断。但超声引导下穿刺活检存在一些限制，如有出血、感染风险，穿刺针途径可能损伤临近重要器官，限制女性经期等［8］。甲状腺癌的液体活检相比于结构性检查有着创伤性小的优点，其中甲基化的研究是当下的热门领域。甲基化是真核生物基因表达调控方式，也是一种特有的表观遗传学现象。基因的高甲基化也参与了多种肿瘤的形成发生与发展［9-11］，DNA 的甲基化水平在国外有些学者的研究中也成为影响甲状腺癌预后的新的评价指标［12］。随着近年来国内外的学者对循环肿瘤DNA（ctDNA）的研究日益增多，有学者发现血液中ctDNA 的含量有助于甲状腺良恶性结节的鉴别诊断［13］。高甲基化水平ctDNA 也被认为是肝癌诊断和预后的重要分子标记物［14］。甲状腺癌患者的临床病理特征决定了术后甲状腺癌患者的进一步治疗方案，DNA 的甲基化水平有望与甲状腺癌患者众多的临床病理特征一样成为指导甲状腺癌患者治疗的一项指标［15］。当前DNA 甲基化检测主要是基于PCR以及二代测序等技术，有耗时长且繁琐、技术要求高、价格昂贵等缺点［16］。因此亟需一种新型的血浆cfDNA 甲基化检测技术。SINA等［17］发现了启动子区高甲基化基团DNA在金表面会聚集成团的特性，并以此用来检测乳腺癌等癌症患者血浆中的cfDNA 电流吸附率水平，以此来衡量乳腺癌等癌症中启动子区甲基化水平。电化学作为一种新兴的检测方法，有着快速、简单、价格低廉的优点，既往文献中没有类似的甲状腺癌血浆cfDNA 吸附率检测方法对甲状腺癌的早期诊断的报道。本研究发现血浆cfDNA 电流吸附率水平（ir 值）对甲状腺癌的早期诊断具有一定的意义；甲状腺癌cfDNA 的ir 值在TI-RADS 分级中差异具有统计学意义（P＜0.05），甲状腺癌高吸附率水平（ir ≥29）在TI-RADS 分级高组的比例明显高于低级组。本研究中ir 值≥29 组与＜29 组在癌灶大小、淋巴结转移、局部侵犯、多中心性、TNM 分

期等甲状腺癌病理特征中的差异无统计学意义（P＞0.05）。经过分析发现ir 值≥29 是甲状腺癌的独立危险因素OR=1.244（P＜0.01）。

表1 ir 值相关的TI-DARS 分级情况Tab.1 Ir value related Ti-DARs grading 例（%）

表2 ir 值与各病理特征之间的相关性分析Tab.2 Correlation analysis between IR value and pathological features例

表3 甲状腺癌危险因素的logistic 回归分析Tab.3 Logistic regression analysis of thyroid cancer risk factors

本研究也具有一定的局限性，甲状腺微小乳头状癌（papillary thyroid microcarcinoma，PTMC）的cfDNA 电流吸附率较低，由于大多数PTMC 是一种惰性疾病，肿瘤发展有限，大多数情况下甚至不生长发展［18］，分析原因可能是释放入血浆的高甲基化水平的cfDNA 量有限，影响cfDNA 电流吸附率，进而对本研究的检测结果产生影响。

血浆cfDNA 电流吸附率水平（ir 值）对甲状腺癌的诊断具有一定的意义；ir 值在癌灶大小、淋巴结转移、局部侵犯、多中心性、TNM 分期等甲状腺癌病理特征中的差异无统计学意义；ir ≥29 是甲状腺癌的一个独立危险因素；ir 值与TI-ADRS 分级相关。本研究结果对甲状腺癌早期诊断，判断预后及给予临床后续治疗有着一定的参考作用。