植物生物刺激剂对茶树重要酶系统和生化成份的调节

李荣林 艾仄宜 杨亦扬 李 欢 穆 兵 陈正涛 史海华 杨建华 吴 威

(1.江苏省农业科学院休闲农业研究所，南京 210014；2.溧阳玉莲生态农业发展有限公司，溧阳 213333； 3.苏州新丰现代农业园，215111)

茶树以嫩梢为主要收获对象，嫩梢早发，多发，持嫩期长，节间短，茶多酚含量适宜，酯型儿茶素相对较多，氨基酸含量较高是大多数茶类对鲜叶品质的一般要求; 光合效率高、抗逆能力强是茶树生长良好的重要参考指标。对茶树危害严重的病、虫有数十种之多，为避免化学农药过量使用造成的不良后果，发展综合防治技术提高茶树自身抗病虫能力尤为必要，近年来茶树化学生态学研究受到重视[1]。然而通常情况下由于品种本身的局限以及环境因素的影响，植物的生长性能和抗逆能力很难达到理想状态，因此使用适当的手段调节和刺激植物的生长发育，调节植物代谢过程成为作物学和作物生理研究的重要方向之一[2]。

使用植物生长调节物质调控茶树的生长很早就有实践，相关研究也从未间断[3-5]，近年使用植物生长刺激素直接调控鲜叶品质，调控茶树光合能力、抗旱能力、抗虫能力，以及促进茶树扦插短穗发根和生长的研究依然受到关注。例如魏吉鹏、韩文炎等研究认为施用外源水杨酸甲酯有利于缓解茶树高温胁迫，增强茶树光合能力[6]。桂连友、苗进研究了茉莉酸甲酯诱导茶树防御茶尺蠖和茶小绿叶蝉的效果及机制[7-8]，孙晓玲等研究指出茉莉酸甲酯诱导可增加茶树挥发物的种类[9]，任恒泽等认为适当以生根剂处理有利于促进茶树扦插短穗生根和发芽[10]，施江、林智等研究发现茉莉酸甲酯处理后的茶树所得鲜叶制成的红茶和乌龙茶品质更优[11]。

在茶树上使用的植物生物刺激剂的类别，过去局限于传统的植物激素[3-5]，近来对水杨酸和茉莉酸关注较多[9-11]。植物生物刺激剂早期确实只包含常见的植物激素，目前概念也没有完全统一，但倾向于将植物生长促进剂、生长调节剂、抗性诱导剂、土壤改良剂等一切具有某种调节植物体内生理过程能力的制剂(包括微生物)都称作植物生物刺激剂[12-13]，简单地说植物生物刺激剂(Plant biostimulants)是指用于植物并可以提高植物营养效率、增强植物应对生物或非生物胁迫的能力或改善作物品质性状的任何化学物质或微生物。从这个理念出发我们认为无论是为了直接促进新梢生长以提高茶叶产量和品质，还是出于生态平衡和食品安全考虑去增强茶树的抗病虫能力，那些具有调节植物生长发育潜力的物质如氨基多糖、超敏蛋白、β-氨基丁酸、龙胆酸等，或是具有刺激茶树生成更多的绿叶挥发物而其本身是茶树挥发物的一部分的物质如青叶醇(顺-3-己烯醇)、芳樟醇(里那醇)、橙花叔醇、法尼烯等[14-17]，它们对茶树或其它植物生理生化的多重影响也值得深入研究。

已知水杨酸、茉莉酸对多种植物具有生理活性，罗汉果上施用茉莉酸甲酯(MeJA)、水杨酸(SA)有利于果实中罗汉果苷和罗汉果醇的积累[18]，水杨酸通过诱导PPO， POD活性升高可使番茄等多种植物抗虫能力提高[19]。甲壳素由天然几丁质(chitin)经过脱乙酰作用而得，不仅具有广泛的生物活性，而且具有生物相容性、血液相容性、微生物易降解性等优良性能，安全性非常高[20-21]。超敏蛋白源于微生物发酵，生物安全性、环境安全性良好，对多种植物病毒病具有很好的诱抗效果[22]。β-氨基丁酸也是一种环境友好的植物免疫诱导剂，可诱导植物抗虫和抗病[23-24]，芸苔素更是普遍认可的植物生长调节剂，具有促进植物生长，增强植物对生物和非生物胁迫防御能力等优良性能[25]。上述物质在茶树上虽有应用，但它们对茶树生理调节的综合能力及其相互之间的比较研究不多。本试验选择水杨酸、茉莉酸甲酯、超敏蛋白、β-氨基丁酸、甲壳素、芸苔素进行探讨。

1 材料与方法

1.1 设备

Eppendorf 5702离心机(德国Eppendorf仪器有限公司)， 液相色谱串联质谱分析仪：Angilent 1290 UPLC色谱系统， ABsciex 4500质谱检测器(美国安捷伦仪器有限公司)。TSQ 8000 EVO气相色谱串联质谱分析仪(美国热电仪器有限公司)， 岛津2020紫外可见分光光度计(日本岛津仪器有限公司)。

1.2 供试茶树

龙井43号，3年生，盆栽(花盆口径33 cm， 高30 cm)，室外自然生长，定期浇水、施肥。

1.3 植物生物刺激剂

氨基丁酸、水杨酸、茉莉酸、甲壳素购于上海Marktin生化制剂有限公司，超敏蛋白购于湖南农大哥科技开发有限公司，芸苔素购于四川兰月科技有限公司。

芸苔素使用浓度为10 mg/L， 其余物质使用浓度为200 mg/L(均以有效成分含量计算)，每种制剂溶液使用量200 mL， 溶液中含1%乙醇，于4月初均匀喷洒于6株茶苗上，对照喷施1%乙醇溶液。24 h后采集1芽2-3叶，样品立即投入液氮中，然后在-80 ℃保存，供测试用。

1.4 酶活性测定

以文献[ 26-27]方法为基础，稍加调整。

1.4.1酶提取 取约1.0 g样品放入25 mL离心管中，加1g交联聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)，预冷的磷酸缓冲液(PBS)10 mL(多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)提取时用pH 6.5的PBS，苯丙氨酸解氨酶(PAL)和过氧化氢酶(CAT)提取时用pH 7.8的PBS)，用匀浆器匀浆，然后4 ℃，6000 g离心15 min，上清液即为所需酶液。

1.4.2多酚氧化酶活性测定 用邻苯二酚比色法，酶活力定义为每克样品吸光度每分钟增加0.1为1个酶活力单位。

1.4.3过氧化物酶活性测定 用愈创木酚比色法，酶活力定义为每克样品吸光度每分钟增加0.1为1个酶活力单位。

1.4.4苯丙氨酸解氨酶活性测定 用290 nm紫外法，每克样品吸光度每分钟增加0.01为1个酶活力单位。

1.4.5过氧化氢酶活性测定 用240 nm紫外法， 以每克样品每分钟内吸光度减少0.1为1个酶活单位。

1.4.6超氧化物歧化酶活性测定[27]用邻苯三酚自氧化法，30s读数1次，以初始反应的自氧化速率代表酶活性，定义0-3 min内反应产物在420 nm的吸光度每1分钟的增加值为1个酶活单位。

1.4.7儿茶素组成测定 样品匀浆，甲醇(含0.1%甲酸，V/V)提取，固液比1∶10，按国标方法(GB/T 8313)进行分析。

1.4.8氨基酸组成测定[28]样品匀浆，甲醇(含0.1%甲酸，V/V)提取，固液比1∶10，用质谱法测定。Waters T3 色谱柱，A相 0.1%甲酸；B相 乙腈(含0.1%甲酸)；柱温40 ℃；进样量1 μL；流速0.3 mL/min，梯度如下：0-3 min 1% B；3-6 min 1%-4% B；6-7.5 min 4%-90% B；7.5-9.3 min 90% B；9.3-9.4 min 90% B-1% B； 9.4-12 min 1% B。质谱检测条件: 离子化模式ESI+，检测方式：多反应检测(MRM)，Curtain Gas:35；Ionspray Voltage:5500；Temperature:450 ℃；Ion Source Gas1:40 ℃；Ion Source Gas2:40 ℃。

1.4.9挥发物分析[29- 30]新鲜叶片液氮磨细，取约2.5 g样品置于20 mL固相萃取瓶内(不加水或溶剂)，插入吸附头(ACAR/PDMS/DVB，预先在250 ℃老化1 h)60 ℃萃取1 h， GC-MS分析。气相色谱条件：色谱柱为TG-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)弹性石英毛细管柱；载气为高纯氦气(纯度99.999%)；载气流速为1.2 mL/min；采用不分流进样；进样口温度为250 ℃；程序升温：初始温度40 ℃保持2 min，然后以3 ℃/min升到100 ℃，保持1 min，再以5 ℃/min升到160 ℃保持1 min，再以10 ℃/min升到280 ℃，保持1 min。质谱条件：离子源为EI源，传输线温度：280 ℃；离子源温度：300 ℃；电子能量：70 eV；扫描范围(m/z)：33-800 amu，采用全扫描采集模式。

检索谱库NIST11。

1.5 统计分析软件

SPSS22，EXCEL2013。

2 结果与分析

2.1 酶活性分析

每一种物质处理都能引起1-2种酶活性的明显上升，超敏蛋白引起SOD活性显著上升，PPO、POD酶活性下降明显，PAL活性也有下降，但不明显。水杨酸甲酯诱导了除PAL以外的其它4种酶活性的显著上升，水杨酸甲酯、甲壳素处理引起PPO、SOD活性的上升较明显，茉莉酸甲酯处理SOD活性极显著上升，水杨酸甲酯、茉莉酸甲酯、芸苔素处理引起POD活性上升，水杨酸甲酯、芸苔素、氨基丁酸处理引起CAT活性增强。

2.2 氨基酸组成分析

茉莉酸酯、水杨酸处理新梢氨基酸总量提高29.18%-33.61%，甲壳素处理后氨基酸总量下降5.72%，而氨基丁酸处理的总氨基酸减少了51.28%。对个别氨基酸而言，芸苔素处理下有多种氨基酸含量略有下降，但茶氨酸上升较多，因此氨基酸总量上升，β-氨基丁酸处理的样品精氨酸增加了42.78%。而在超敏蛋白处理下茶氨酸含量下降较多，但其他氨基酸大部分有所上升，因此氨基酸总量也趋于上升。

表1 植物生物刺激剂处理下的茶树新梢酶活性变化(U)

表2 植物生物刺激剂处理与新梢氨基酸组成变化(mg/100 g鲜重)

2.3 儿茶素组成分析

所有处理都使儿茶素总量上升，除芸苔素处理增加13.88%，其余增加了46.23%～114.6%，其中非酯型儿茶素总量增长幅度22.87%-143.4%，酯型儿茶素总量增加幅度为13.87%-114.6%，增幅最高的是EGCG，水杨酸甲酯和超敏蛋白处理分别增加101.0%-107.2%，茉莉酸甲酯处理的EGCG增加了92.45%，甲壳素处理增加了64.96%， β-氨基丁酸处理增加了45.66%，只有芸苔素处理EGCG增加4.52%。

表中峰面积数据是将样品质量归一化，按1g计算所得。本试验条件下茉莉酸处理后挥发物总量与对照相比微有增加(+2.11%)，水杨酸处理总量减少22.72%，其它处理减少3.79%-13.43%。以单一组分而言，青叶醇及其酯类(2-Hexen-1-ol，4-Hexen-1-ol， acetate)、青叶醛(2-Hexenal)是增加的或基本不变，所有处理己烯己酸酯(4-Hexen-1-ol， acetate)总量都增加，处理后的含量是对照的2-3倍。

表3 植物生物刺激剂处理的新梢儿茶素组成变化(鲜重%)

大多数挥发性组分在处理后它在挥发物总量中所占比例变化较小，也有少数变幅较大。(Z)-4-Hexen-1-ol， acetate在对照组里占总量的比为3.714%，在芸苔素处理组占总量7.708%， 而在其它各组中该物质在挥发物总量中所占比例为9.509%-11.65%。又如， (Z)-2，6-Octadien-1-ol， 3，7-dimethyl-(nerolidol橙花叔醇)是茶树挥发物中占比最高的物质，在对照组占总量的35.94%，然而各处理组该成份所占比例为22.34%-27.60%，平均25.03%，虽然与对照相比变异较大，而在各处理之间差异较小。1，6-Octadien-3-ol， 3，7-dimethyl-(linalool 芳樟醇)是挥发性组分中所占比例仅次于nerolidol的成分，在对照中占总量18.42%，在各处理组中占比19.34%-21.19%，不仅与对照相比变化较小，各处理之间变异也很小。也有一些物质像 cyclopropanecarboxyllic acid， tridec-2-ynyl ester；methane， isothiocyanato在各处理之间变异就较大。

用余弦分析法[30]得到各处理与对照之间的相似度是：氨基丁酸 0.9591，芸苔素0.9620，甲壳素0.9508，超敏蛋白0.9552，水杨酸0.9163，茉莉酸0.9239，经水杨酸和茉莉酸处理后挥发物组分发生的变化更大。

3 讨论

外源激素能够引起植物的多重生理学响应，包括促进内源茉莉酸、水杨酸信号分子的合成，诱导抗性基因包括防御基因、防御物质合成基因和信号途径基因的表达并提高植物的抗逆能力[31]。橡胶树受茉莉酸甲酯处理后热激转录因子Hsfs家族中有20个成员上调表达，进而提高橡胶的耐热能力[32]。杭白菊经茉莉酸甲酯处理可诱导CmAOS和CmCOI1 基因表达的上调，促进内源茉莉酸的合成，显著提高叶片保护酶、防御酶活性及次生代谢物含量，降低了丙二醛、可溶糖含量[33]，茉莉酸诱导增强茶树抗病虫能力的机制也和茶树多酚氧化酶和苯丙氨酸解氨酶的活性上调以及黄酮类物质的积累有关[7-8]。

苯并噻二唑(BTH)和 β-氨基丁酸(BABA)可以通过激活水杨酸(SA)反应机制促进植物免疫，草莓受到BTH和BABA处理叶片蔗糖非发酵-1-相关蛋白激酶1(SnRK1)活性显著升高，叶片净光合速率、可溶性糖和淀粉含量以及幼苗生长量均有提高。处理4 h显著提高了SnRK1家族基因FaSnRK1s和SnRK1下游基因FaASN1、FaUDG、FaDPS等的相对表达量[34]。外源喷施BABA可促进蚕豆过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)等酶的活性升高[35]。

将Harpin(HP)蛋白编码基因导入大豆，检测发现水杨酸信号途径关键基因PR1、PR12表达量均表现出明显的上调。茉莉酸信号途径基因AOS表达量在叶片上微弱上调， PPO基因明显上调，细胞程序性死亡基因GmNPR1和GmNPR2明显上调，上述基因在抵抗大豆疫霉根腐病的侵染时均起到重要作用[36-37]。油菜素内酯处理过的拟南芥内源基因XTH19和XTH23表达量显著增强，这是油菜素内酯缓解盐胁迫下拟南芥侧根发育受阻的重要原因[38]。甲壳素通过对保护酶系统的基因调节，以及对逆境胁迫下植物毒素合成的抑制提高作物抗性，改善作物品质[39]。植物经SA，JA，HP，花生四烯酸诱导处理后酚代谢途径激活，酚含量上升[40]。

上述研究显示，植物生物刺激剂促进作物生长，提高作物防御能力的基本机制是诱导内源激素的合成，诱导特定关键基因上调，基因表达上调的结果是植物多酚合成增加，植保素合成增强，保护酶系统活性显著升高，光合能力增强等。

本研究结果表明，在植物生物刺激剂诱导下茶树新梢酶活性得到调节，但每一种物质引起的效应不同，一般一种物质只引起1-2种酶活性的上升，这提示不同调节物质组合使用可能会效果更好。诱导处理下单一氨基酸可能有增减，但氨基酸总量基本上都是上升的，儿茶素单一组分则显示除少数情形外大多数都趋于增加，尤其是EGCG增加较多。本试验条件下，植物生物刺激剂处理后挥发物总量与对照相比基本没有增加，甚而有减少(水杨酸、芸苔素处理)，这与其它报道有所差异[7-8，11]。

茶叶生产过程相较于一般作物生产复杂程度要高许多，茶叶收获的主要对象是新生茶梢(鲜叶)，但新梢本身必须通过复杂的加工才能成为可交换的各种商品。在这个生产体系中，首先要保证收获足够数量并且优质的鲜叶，即是需要追求产量又要追寻满足一定质量条件的收获物，鲜叶的产量和品质是茶树品种、生长环境、栽培管理(包括病虫危害的控制)技术实施的综合结果。而茶叶加工工艺参数的选择也将取决于新梢的各种物理、化学特性，成品的品质更是鲜叶基本理化特性和加工工艺的复杂统一性的体现[41-42]。在这样的多重目标下，无论仅仅着眼于栽培管理还是着眼于加工都难以达到预期目的。以栽培管理为手段提高鲜叶产量和基础品质，从加工着手提高品质潜力都是适当的方法，而如何直接贯通这两个环节也显得非常重要。

植物生物刺激剂的使用可能是重要的途径之一。本试验通过各种植物生物刺激剂的使用发现，首先所选植物生物刺激剂能够提高茶树鲜叶氨基酸含量和儿茶素含量，这2类物质是茶叶中最主要的品质成分，显然适当使用植物生物刺激剂能够提高鲜叶的生化品质，进而为提高成品茶品质奠定基础。氨基酸总量提高无论从哪方面看对茶叶生产都是有益的，氨基酸含量提高是茶树生长旺盛、茶树抗逆能力增强的标识，提高氨基酸含量是茶树鲜叶品质和茶叶产品品质追求的重要目标。每一种氨基酸又有其特定的生理功能，例如脯氨酸、精氨酸参与植物的抗逆活动，谷氨酸参与叶绿素合成和光合作用，蛋氨酸与植物防御氧化胁迫有关，苯丙氨酸是茶树二级代谢物质酚类、萜类合成的重要库源[42-43]。

对个别氨基酸的变化与植物生理反应之间的关系一一对应去研究可能会获得更多有用信息，通过对不同激素处理下单一氨基酸变化的精细分析，并结合具体的生理调控目标可以帮助我们选择适当的植物生物刺激剂。茶氨酸是茶树叶片中含量最多的氨基酸，在茶树氮代谢中起到中枢作用，在茶叶香气的形成，茶叶的呈味反应，茶叶的健康功能等各个方向都发挥着重要作用[41-42]。氨基酸有鲜味(谷氨酸、天冬氨酸、茶氨酸)、甜味(丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸)、苦味(亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸)等不同呈味反应，长期以来我们主要是关注鲜味和甜味氨基酸，认为茶叶的鲜爽、回甘特性与氨基酸有密切关系，但因为有众多氨基酸呈现苦味特征，它们对茶叶感官品质的具体影响还不甚清楚，使用植物生物刺激剂后引起苦味氨基酸比例的显著改变是否会影响茶叶的品质也有必要继续探讨。

除超敏蛋白外，本试验所用植物生物刺激素各自至少能提高一种酶的活性。PPO， POD， PAL， CAT对茶树和茶叶生产具有多重意义[44]。PPO，POD是酚类代谢的关键酶，昆虫食物中的酚类经这两种氧化酶催化生成木质素及醌类化合物，构成保护性屏障阻碍昆虫取食，同时可以与蛋白结合抑制昆虫的营养吸收。CAT参与植物应对昆虫取食或非生物胁迫反应，参与植物信号分子H2O2的平衡调节。PAL是植物体内次生代谢反应的关键酶和限速酶，催化苯丙氨酸合成酚类化合物，并与水杨酸代谢途径关联形成植保素、木质素、类黄酮等抗营养物质或抑菌物质，因而在病虫害防御中具有关键作用[45-46]。

在茶树上使用青叶醇、香叶醇、芳樟醇、a-法尼烯等诱导对茶小绿叶蝉或茶尺蠖产生抗性的主要机制之一是PPO， PAL基因表达及相应酶活性的上调[7-9，15-17]。水杨酸增强茶树抗旱能力的机制也与PPO， PAL， CAT活性上调紧密相关[6]。PPO，PAL， POD， SOD， LDH，CAT号称为6大防御酶系[45]。基因表达及其调控过程非常复杂，但这是我们系统理解植物生理变化本质的重要途径，本试验没有对此进行深入探究，有待今后完善。

多酚氧化酶和过氧化物酶也是红茶品质形成所依赖的关键酶[42]，为获得品质优良的红茶，不仅希望适当提高鲜叶多酚氧化酶和过氧化物酶的活性，而且希望在制茶过程中2种酶的活性一直能维持较高的水平，高活性的多酚氧化酶和过氧化物酶对于茶黄素的积累， 对于香气的形成和转化都是有益的。

附表1 氨基酸的多反应检测参数(T3)

已有的研究表明，茶树挥发物除了作为成品茶叶香气形成的关键物质基础外，还具有非常重要的生态功能，例如作为信号物质物质对邻近植株进行预警，作为信息物质对害虫和天敌的行为发生深刻影响[1]。作为香气物质基础我们希望挥发物总量、特定挥发性物质(例如芳樟醇、香叶醇、苯乙醇等)含量有所增加，本试验中除茉莉酸酯和超敏蛋白诱导了芳樟醇的增加，其它各处理挥发物总量，芳樟醇、香叶醇含量与对照相比都有所下降，与预期结果有较大差异，需要对各物质的使用浓度、次数，使用时期以及茶树挥发物的收集和分析方法做进一步试验。本试验条件下青叶醇类物质有明显增加，制茶过程通常要用适当方法使青叶醇有所减少，但青叶醇也是茶叶新鲜香气的重要基础，鲜叶中青叶醇含量保持适当水平还是有益的。本研究显示植物生物刺激剂有可能会引起茶树挥发性组成比例的较大变化，如能清楚这些挥发物的确切生态功能或者它们在茶叶香气构成中的作用，对茶叶香气调控，茶树害虫生态控制是非常有用的。挥发性组分的变异点不同，说明各种植物生物刺激剂的基因调控节点不同，这为茶树挥发性组分的定向调控提供了启示，值得通过多种手段进一步研究。