乙酰胆碱酯酶基因启动子区多态性与散发性阿尔茨海默病的关系

赵 蕾

（北京市石景山医院，北京 100043）

阿尔茨海默病（Alzheimer"s disease，AD）是一种以进行性认知受损为主要表现的中枢神经系统变性疾病，而乙酰胆碱酯酶（Acetylcholinesterase，AChE）是生物神经传导中的一种关键酶。目前大多数学者研究表明在AD 患者的脑中AChE 的活性明显降低，而且下降程度与痴呆的严重程度密切相关，特别在患者的大脑皮层和海马结构中下降尤为明显。近年来国外对AChE 研究较多，如2010 年，WU 等发现了AD 患者的胆碱能神经元丢失，乙酰胆碱水平下降，乙酰胆碱受体功能障碍［1］。2005 年，RVON 等发现AD 患者的胆碱能系统受损，血清中AChE 活性明显下降［2］。国内近年亦有相关研究，2002 年贾建平等研究结果显示：AD 患者脑脊液中的乙酰胆碱含量显著低于对照组并且与简易智能状态量表（MMSE）评分呈正相关［3］。2020 年陈淑子等研究结果显示AD 患者血浆中AChE 活性明显低于对照组，并且随着AD 的进展，AChE 水平逐渐降低［4］。

有关AChE 基因的多态性报道较少，2000 年以前只发现了5 个有关人AChE 基因的多态性位点［5-6］。2004 年，HASIN 等共发现了13 个AChE 基因的单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism，SNPs）［7］。2000 年SHAPIRA 等研究了AChE 基因启动子上游22 kb 的6 个区域，只发现存在2 个邻近的突变［8］。鉴于AChE 与AD 发病的密切关系，我们推测AChE 基因启动子区可能也存在着影响AD 发病的多态性位点。因此，本研究从AChE基因启动子区入手，探讨中国汉族人群中AChE基因启动子区多态性与散发性阿尔茨海默病（Sporadic Alzheimer"s diseases，SAD）发病的关系，以期为SAD的发病机制提供实验和理论依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象2000 年—2010 年间首都医科大学宣武医院门诊及住院患者，所有患者均进行简易智能状态检查（MMSE）评分和临床痴呆评定量表（CDR）。采用1984 年美国国立神经病、语言障碍和卒中及阿尔茨海默氏病和相关疾病协会（NINCDSADRDA）制定的临床诊断标准，把诊断为“很可能AD”的患者列为SAD 组，患者具备至少1 名神经科专家的临床诊断证明。SAD组共272例，其中男132例，女140 例；平均年龄（70.2±7.5）岁，平均发病年龄（68.5±5.8）岁。

2000 年—2010 年间宣武医院门诊体检者，且均经简易智能状态检查（MMSE）评分和临床痴呆评定量表（CDR）和门诊系统体检证实为健康人列为正常对照组。排除严重心、肝、肾及其它全身性系统性疾病者，神经或精神系统疾病者，药物滥用者。正常对照组共278 例，男135 例，女143 例；平均年龄（69.2±8.0）岁。

两组老年人家族中均无AD 患者，均为中国北方汉族人群。

1.2 AChE 启动子区多态性位点筛查随机选取10 例SAD 患者DNA 标本和10 例正常对照者DNA标本，用标准PCR 方法扩增AChE 基因第1 外显子上游1 196 bp 的近似启动子区（位于第1 外显子上游-1 321 至-125 区），用直接测序的方法对其进行系统筛查（引物序列见表1）。PCR 产物送国家人类基因组北方研究中心测序。

表1 各位点引物序列及分型方法

1.3 多态性分型对筛查出的多态性位点用PCR-RFLP 方法、DHPLC 或直接测序的方法进行大样本的多态性分型（引物序列见表1）。所有标本进行载脂蛋白E（APOE）分型。

1.4 遗传学统计分析用HWE 程序检测各位点是否符合Hardy-Weinberg平衡。等位基因和基因型频率在SAD 患者和对照者中的分布差别用SPSS 11.5 统计软件包的卡方检验。用Logistic 回归校正年龄、性别和APOE 等因素的影响。连锁不平衡分析（D"和r2）、单体型频率及与疾病的关联强度在http：//analysis. bio-x. cn/myAnalysis. php 上计算。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 AChE 启动子区多态性位点的筛查结果我们随机选取10 例SAD 患者和10 例正常对照者，对他们的AChE 近似启动子区1 196 bp 片段进行直接测序。初步筛查发现中国汉族人群中存在2个多态性位点，分别为：rs17883319GC/--和rs3757869A/C。

2.2 多态性的分型结果用PCR-RFLP 方法对rs3757869A/C 位点进行大样本分型，PCR 扩增的456 bp片段经Csp6Ⅰ酶切后，A/A纯合型呈292 bp和164 bp两条带；A/C杂合型呈456 bp、292 bp和164 bp三条带；C/C纯合型呈456 bp一条带（图1）。

对AChE 启动子区rs17883319GC/--多态性扩增295 bp 的片段，用DHPLC 方法进行分型，GC/--杂合型在色谱图上呈双峰；GC/GC 和-/-纯合型均呈单峰（图2）。再将未知纯合型与已知纯合型按1∶1 配比混合，94 ℃7 min 变性后室温冷却复性30 min，重新用DHPLC方法进行分型，若为单峰则其基因型与已知纯合型相同，若为双峰则其基因型与已知纯合型相异（表2）。

图1 rs3757869A/C位点酶切后电泳胶图

图2 rs17883319GC/--位点DHPLC分型色谱图

2.3 遗传学统计分析结果采用HWE 程序检测，经检验APOE、rs17883319GC/--和rs3757869A/C 多态性位点的基因型分布在SAD 组和对照组中均符合Hardy-Weinberg 平衡定律（P＞0.05），说明两组人群均具有代表性。

对AChE 启动子区多态性位点的统计分析得出，rs3757869A/C 和rs17883319GC/--多态性的等位基因和基因型频率分布在SAD 组和对照组之间差异无统计学意义（P＞0.05），在进行APOE分层分析后得出，在携带与不携带APOEε4 的亚组中差异均无统计学意义（见表2～3）。采用Logistic 回归分析校正年龄和性别等因素的影响后仍未发现这两个多态性位点与AD发病风险之间存在关联（P＞0.05）。

表2 rs17883319GC/--多态性位点基因型及等位基因频率的分布/n（%）

表3 rs3757869A/C多态性位点基因型及等位基因频率的分布/n（%）

此外，我们对以上两个多态性位点进行了连锁不平衡分析，并未发现这2 个多态性位点存在显著连锁不平衡（D"=0.515，r2=0.106）。

3 讨 论

随着老龄化社会的迅速发展，AD 越来越成为严重的社会和家庭问题，但其病因及发病机制至今并未完全阐明。目前，AD 的发病被认为是遗传易感性及环境因素共同作用的结果［9］。多基因缺陷是当前AD 有关遗传学研究的共识［10］。目前已证实4种基因的突变或多态性与AD 发病有关：淀粉样前体蛋白（APP）、早老素1（PS1）、早老素2（PS2）和APOE 基因。其中APP、PS1 和PS2 基因与家族性早发型AD 有关，位于19 号染色体的APOE 基因的ε4等位基因是目前唯一公认的散发性AD 的风险基因，AD 患者携带APOEε4 等位基因的频率是40%［11］。在AD发病机制中老年斑中过度沉积Aβ的细胞毒性作用是AD 发病的关键因素［12-13］，Aβ 寡聚体又能够诱导另一个病理改变tau 蛋白过度磷酸化［14］。而近年来研究表明AChE 通过其外周的阴离子位点与老年斑的成分构成了稳定的复合物，在AD 患者脑中AChE 的糖基化改变与Aβ 的形成具有紧密的关联［13］，还有研究表明AChE 通过与神经纤维形成一种复合物加速Aβ的聚集［15-16］。

人的AChE 基因定位于7 号染色体长臂7q22上，包含6 个外显子和5 个内含子。2000 年以前只发现了5 个有关人AChE 基因的多态性位点，其中3个在外显子：H322N、P446P 和P561R［5］；另外2 个在第5 内含 子［6］。2004 年，HASIN 等 共 发 现 了13 个AChE 基因单苷核酸多态性，它们中有5个可以产生氨基酸取代改变［7］。有关AChE 基因启动子区多态性的研究较少，2000 年SHAPIRA 等研究了AChE 基因启动子上游22 kb 的6 个区域，发现存在2 个邻近的突变：一个是T→A 替代，改变了假定的糖皮质激素应答成分（GRE）的结合位点；另一个是4 个碱基的缺失，缺失了1 个或2 个邻近的肝细胞核因子3（HNF3）结合单位，并且在缺失突变和ACHE 编码区的H322N 突变之间存在连锁不平衡关系［8］。鉴于AChE与AD发病的密切关系，我们推测AChE基因启动子区可能也存在着影响AD发病的多态性位点。

我们研究发现中国汉族人群的AChE 基因启动子区存在两个多态性位点：rs17883319GC/--和rs3757869A/C。经遗传统计学分析，得出这两个多态性的等位基因和基因型频率在SAD 组和对照组之间差异均无统计学意义（P＞0.05），采用APOE分层分析、Logistic 回归分析及连锁不平衡分析后仍未发现此基因启动子区多态性与SAD 发病风险之间存在关联。2007年PICCARDI M 等对撒丁岛人样本进行过类似研究，他们对158 例AD 患者和118 例健康对照进行了AChE 基因多态性与AD 发病风险的相关性研究，结果显示AChE 基因多态性的等位基因和基因型频率在AD 组和对照组之间无显著差异，单体型分析后仍未发现此基因多态性与AD 发病风险之间存在关联［17］。

我们的研究结果未发现AChE 基因启动子区多态性与SAD 发病相关，提示该基因启动子区多态性与SAD 发病的关系可能并不十分密切，AD 是多基因遗传疾病，AChE 基因可能不是引起AD 发病的主要基因；其他非编码区多态性位点的筛查及功能有待进一步的研究，此结论尚需在更大规模的人群中进行证实，这将有助于为AD 的发病机制提供理论依据并进一步指导AD的临床治疗。