美洲大蠊提取物对人肺腺癌HCC-2935细胞增殖和凋亡及周期的影响*

黄丽，康哲，翟素珍，张春林，蔡莉

(1.贵州医科大学 基础医学院 生物学系，贵州 贵阳 550025；2.贵阳市白云区医院 妇产科，贵州 贵阳 550014)

肺癌是我国乃至全世界发病率和致死率最高的恶性肿瘤，其中肺腺癌(lung adenocarcinoma,LUAD)是肺癌中最主要的病理类型，占所有肺癌患者的80%～85%[1]，其治疗亦是全球性的一大难题[2-4]。近年来，中药治疗与手术、放疗及化疗相比，具有多环节、多成分、多靶点效应及减毒增效的优势[5-8]。美洲大蠊(periplanetaamericanaL.)俗称“蟑螂”，是一种蜚蠊科昆虫[9]。美洲大蠊入药在《神农本草经》中已经记载[10]，至今以其为原料已研制出多种新药，如心脉龙注射液、康复新液、肝龙胶囊及癥益肝片等[11]。众多研究表明，美洲大蠊提取物(periplanetaamericanaextract,PAE)具有抗氧化、抗菌、抗病毒及抗肿瘤等广泛的药理活性[12-14]。目前PAE在肺癌方面的研究少有报道[15]，且具体的作用机制尚不完全清楚。本研究以人LUAD HCC-2935细胞为研究对象，探究PAE对HCC-2935细胞增殖、周期及凋亡的影响，为PAE应用于LUAD的临床治疗提供新的基础理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1细胞株与成虫 人LUAD细胞株HCC-2935由贵州医科大学分子生物学重点实验室惠赠，美洲大蠊成虫取自贵州医科大学基础医学院生物学系蜚蠊养殖房，PAE经90%乙醇冷浸提取获得。

1.1.2主要试剂与仪器 RPMI-1640培养基(美国Gibco)，胰蛋白酶和胎牛血清(美国Sigma)，二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)、四唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒、膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(annexin V-FITC/PI)细胞凋亡检测试剂盒和细胞凋亡荧光Hoechst 33342/PI(propidium iodide，PI)双染试剂盒(北京Solarbio)，顺铂(上海恒远)；ELX808酶标仪(瑞士宝特)，BDS200倒置生物学显微镜(重庆奥特)，流式细胞仪(美国NovoCyte)，371直热式CO2恒温培养箱(美国Thermo)，QL 901旋涡振荡器(海门市麒麟医用仪器)。

1.2 方法

1.2.1细胞培养与分组 人LUAD细胞HCC-2935使用含有10%胎牛血清和1%双抗的RPMI-1640培养基，置于37 ℃的5%CO2培养箱内培养，使细胞均匀贴壁生长，取生长良好、形态均一的对数生长期细胞进行后续实验，并分为对照组、PAE组及顺铂组。

1.2.2MTT法检测细胞增殖 取对数生长期各组细胞调整为1×108个/L的细胞悬液，按100 μL/孔接种于96孔板，37 ℃、5%CO2培养箱内培养过夜；PAE组细胞中分别加50、100及200 mg/L PAE，对照组细胞加等体积浓度含血清的RPMI-1640培养基，顺铂组细胞加等体积浓度的40 mg/L顺铂，每个浓度设置5个副孔，培养24、48 h；每孔加5 g/L MTT 20 μL，继续培养4 h后弃上清液，加DMSO 150 μL，震荡混匀，酶标仪于490 nm处测定吸光度(optical density，OD)；每组重复3次实验，计算各组细胞增殖抑制率[细胞增殖抑制率(%)=(1-处理组OD值/对照组OD值)×100%]，筛选出给药的有效作用时间。

1.2.3流式细胞仪检测细胞凋亡 将对数生长期的各组细胞按2×105个/孔接种于6孔板，置于37 ℃的5%CO2培养箱中培养过夜；将不同浓度的PAE、含血清的RPMI-1640培养基和40 mg/L顺铂加入各组对应孔；给药作用48 h后，采用胰酶消化并收集各组细胞，磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline,PBS)洗涤2次，分别加Annexin V-FITC和碘化丙啶(propidium iodide，PI)各5 μL，室温避光孵育30 min，采用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率；每组重复3次，取其细胞数的平均值。

1.2.4流式细胞仪检测细胞周期 将对数生长期的各组细胞按3×104个/孔接种于6孔板中，将不同浓度的PAE、含血清的RPMI-1640培养基和40 mg/L顺铂加入各组对应孔中；给药处理48 h后，采用胰酶消化并收集各组细胞，PBS洗涤，用预冷的70%乙醇4 ℃固定过夜；PBS洗去残留的乙醇，PI低于4 ℃的避光条件下细胞染色30 min，用流式细胞仪检测各组细胞的生长发育周期变化。每组重复3次实验，计算染色平均值。

1.3 统计学分析

应用SPSS 22.0软件对实验数据进行统计分析，计量资料组间比较使用单因素方差分析，组间比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞增殖

MTT法检测结果显示，与对照组相比，不同浓度的PAE组和顺铂组HCC-2935细胞增殖抑制率明显升高(P<0.01)；在同一时间点随PAE浓度的增加，HCC-2935细胞增殖抑制率逐渐升高(P<0.01)；相同PAE浓度时，各组作用48 h的抑制效应较作用24 h明显增强(P<0.01)，显示PAE抑制HCC-2935细胞的增殖呈时间-剂量依赖性；24和48 h作用时间下200 mg/L PAE组HCC-2935细胞增殖抑制率较顺铂组明显上调(P<0.01)。因此，在后续研究中选取给药48 h作为研究的有效作用时间点。见表1。

表1 各组HCC-2935细胞增殖抑制率Tab.1 Comparison of proliferation inhibition rates of HCC-2935 cells in each

2.2 细胞凋亡

流式细胞仪检测结果显示，与对照组比较，50、100及200 mg/L PAE组HCC-2935细胞凋亡率逐渐升高，呈剂量依赖性(P<0.01)；其中200 mg/L PAE组HCC-2935细胞凋亡率较顺铂组升高，差异有统计学意义(P<0.01)。见图1。

注：(1)与对照组比较，P<0.01；(2)与顺铂组比较，P<0.01。图1 各组HCC-2935细胞凋亡率 Fig.1 Effects of different concentrations of PAE on apoptosis of LUAD HCC-2935 cells

2.3 细胞周期

流式细胞仪检测结果显示，与对照组相比，40 mg/L顺铂组HCC-2935细胞于G0/G1期所占百分比升高，在S期和G2/M期的百分比降低(P<0.05)，表明细胞周期被阻滞于G0/G1期；50、100及200 mg/LPAE组HCC-2935细胞于G0/G1期和S期的百分比较对照组降低，在G2/M期细胞所占百分比较对照组升高(P<0.05)，推测细胞周期被阻滞于G2/M期。见图2。

注：与对照组比较，(1)P<0.05，(2)P<0.01，(3)P<0.001。图2 不同浓度PAE对HCC-2935细胞周期的影响Fig.2 Effect of PAE on the cycle of HCC-2935 cells

3 讨论

目前LUAD的发病率和死亡率一直居高不下，主要在于其术后复发性高、耐药性及高转移性[16]。以顺铂为代表的铂类联合其他化疗药物是临床治疗LUAD的一线方案[17]，虽然多数患者在化疗初期对药物敏感，但后期疗效欠佳，铂类耐药已成为临床治疗LUAD的难题[18]。因此，临床迫切需要毒副作用低、治疗效果好且逆转耐药的LUAD化疗药物。

美洲大蠊作为世界上最古老的昆虫，能适应各种阴暗恶劣环境，在数亿年的进化历程中其体内必形成了独特防御机制的某些特殊生化物质[19]。纯天然虫类中药材美洲大蠊逐渐受到国内外学者的广泛关注，其提取物在多种肿瘤中被证实具有较好的抗肿瘤活性[20-22]。如刘童婷等[23]认为PAE可抑制结肠癌HCT 116细胞增殖，具有诱导HCT 116细胞凋亡的作用；杨蕊菲等[24]研究指出，PAE可能通过下调Ras/Raf/ERK1/2信号通路诱导肝癌SMMC-7721细胞凋亡，抑制其增殖。由此可见，PAE可通过抑制肿瘤细胞生长及诱导细胞凋亡等机制来调控肿瘤的恶性进展。鉴于PAE在肺癌临床治疗中的实验依据还不够充分，具体的作用机制尚不完全清楚，故本课题组开展了相关研究。本研究的结果与上述研究相符，结果显示PAE对LUAD HCC-2935细胞的增殖抑制作用随着药物浓度的增加逐渐增强，且作用48 h的抑制效应较24 h明显增强，提示PAE能够呈时间-剂量依赖性有效抑制LUAD HCC-2935细胞增殖。本研究还发现高浓度(200 mg/L)PAE的细胞增殖抑制率显著高于40 mg/L顺铂，提示天然中药美洲大蠊抑制LUAD细胞具有增效减毒的作用，为PAE在肿瘤化疗中作为辅助用药提供了试验依据。临床治疗中可考虑PAE联合铂类药物治疗LUAD，以增加抗肿瘤治疗敏感性。

细胞凋亡为一个多基因、多阶段和多途径共同作用的复杂过程，细胞凋亡的异常是导致细胞不能程序性死亡而影响肿瘤恶性进展的重要因素之一[25]。细胞周期调控紊乱亦可导致肿瘤细胞异常增殖[26]。本研究通过流式细胞仪检测，结果显示低、中、高浓度的PAE处理LUAD HCC-2935细胞48 h后，其细胞凋亡率逐渐升高，另细胞于G0/G1期和S期所占百分比较对照组明显降低，而在G2/M期所占百分比较对照组明显升高，提示PAE呈剂量依赖性诱导LUAD HCC-2935细胞凋亡，且细胞被阻滞于G2/M期。这与王晶[27]报道的PAE可诱导肺癌 H125细胞凋亡，阻滞肺癌H125细胞于S期的结果不相吻合，推测与研究的细胞株及细胞所处的周期不相同有关。

本研究是在体外环境下探讨PAE对人LUAD HCC-2935 细胞增殖与凋亡的作用，但机体内存在诸如酶活性、代谢等影响因素，故PAE在体内环境中抑制LUAD细胞增殖的作用机制、细胞凋亡的相关信号通路及分子靶点还有待后续进一步深入研究。