血清4型禽腺病毒感染SPF鸡体内各组织中病毒的动态分布及排毒规律

栾勇娇，谢芝勋，王 盛，罗思思，张 蕾，谢丽基，谢志勤，邓显文，张民秀，张艳芳，曾婷婷，范 晴 (1.广西大学 动物科学技术学院，广西 南宁 530004；.广西壮族自治区兽医研究所 广西兽医生物技术重点实验室，广西 南宁 530001)

禽腺病毒(avian adenovirus,FAdV)属于腺病毒科腺病毒属，是没有囊膜的双链DNA病毒，可分为5个种(FAdV-A～E，12个血清型(FAdV-1～8a和8b～11)[1]。FAdV引起鸡和其他禽类的疾病主要有包涵体肝炎[2]、心包积液综合征[3]和胃溃疡[4]。1987年，巴基斯坦安卡拉地区首次发现了一种可引起禽类出现心包积液和包涵体肝炎病理变化的疾病，因此称为“安卡拉病”[5]，又称为心包积液-肝炎综合征(hydropericardium hepatitis syndrome,HHS)，经鉴定该病的病原是血清4型禽腺病毒(FAdV-4)，随后该病在世界上的多个国家流行，如澳大利亚、印度、韩国、日本、伊拉克、智利和南非[6-11]，给全球各地的家禽养殖业产生了严重的经济影响。2014年以前，我国零星分离到FAdV[12]，自2015年6月，由高致病性的新型FAdV-4引起的HHS在我国山东、河南、安徽、河北、吉林等省份暴发并迅速传播[13]。有报道称种鸡、蛋鸡、杂交鸡、蛋鸭和鹅也可能感染此病毒[13-15]，因此，HHS已成为危害我国养禽业的重大疾病之一，严重制约我国家禽产业的发展。

目前研究发现，FAdV-4主要侵害3～6周龄的肉鸡，死亡率20%～100%[16]，感染该病的典型症状是心包内积有淡黄色的液体，肝脏肿大、有出血或坏死，肾脏肿大、苍白[17]。感染该病后，肝脏是其主要的靶器官[18]，组织学上主要表现为肝细胞内可见核内包涵体[19]。HHS可通过水平和垂直两种方式进行传播，传染性强[20]。近几年国内外关于FAdV-4的研究较多，主要是致病性研究[18,21]和疫苗研制[22-23]，LI等[24]在FAdV-4山东分离株的致病性研究中，检测接种后前几日病理变化较为明显的部分组织器官和泄殖腔棉拭子中的病毒载量。而全面系统的研究FAdV-4感染鸡后，病毒在鸡体内不同组织器官的分布规律以及鸡的排泄规律的相对较少。

为了探索FAdV-4在鸡体内发生发展的过程、趋势及规律，本试验以SPF鸡为实验动物，人工感染FAdV-4，通过RT-PCR跟踪检测感染后SPF鸡组织器官的病毒载量和排毒情况，研究FAdV-4感染SPF鸡体内组织的分布和排毒，分析其动态变化规律，为FAdV-4致病机理研究提供理论依据，并为FAdV-4的防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 毒株与SPF鸡胚FAdV-4-GX2019-010毒株由本实验室分离、鉴定、纯化并保存；SPF鸡胚购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。

1.2 主要试剂和仪器Universal Genomic DNA Kit购自北京康为世纪生物科技有限公司；PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix 购自Invitrogen公司；磷酸盐缓冲物(PBS)、DMEM/F-12培养基购自Corning公司；胎牛血淸(FBS)购自Gibco公司；NanoDrop 2000、Applied Biosystems QuantStudio 5实时荧光定量PCR仪购自ThermoFisher Scientific公司。

1.3 病毒的增殖取17～18日龄SPF鸡胚，用75%的酒精消毒蛋壳表面，制备鸡胚原什肝细胞(CEL)，置于37℃、5% CO2生化培养箱中培养，待其长成单层，取一定量病毒上清液接种细胞，培养并观察2～3 d，待大部分细胞出现典型的细胞病变(CPE)，低速离心收集细胞并重悬于DMEM中，反复冻融，振荡3次，于4℃、12 000 r/min离心5 min，收集病毒上清于液氮中保存备用。

1.4 病毒TCID50的测定将CEL在96孔细胞培养板培养至单层，10倍梯度稀释，接种96孔细胞板，每个稀释度重复6个孔，并设置阴性对照，连续观察7 d，并记录CPE，按Reed-Muench法计算病毒的TCID50为10-7.2/mL。

1.5 人工感染SPF鸡及样品采集将100只3周龄SPF鸡随机分为2组：试验组50只，对照组50只。试验组的SPF鸡以0.2 mL/只(TCID50=105.5/mL)的剂量通过滴鼻点眼接种病毒，对照组接种相同剂量的无菌PBS。每日观察鸡只精神状态，于感染后1、2、3、4、5、6、7、10、14、21 d随机抽取试验组和对照组3只鸡，采集咽喉拭子和泄殖腔拭子，放于1 mL含四抗(青霉素、链霉素、庆大霉素、制霉菌素)的PBS中，-80℃保存用于检测SPF鸡的排毒情况。剖杀并观察病变情况，采集胸肌、肝脏、心脏、脾脏、肺脏、腺胃、胰腺、法氏囊、肾脏、胸腺和脑，-80℃ 保存用于病毒载量的测定。

1.6 病毒DNA的提取及RT-PCR检测组织和棉拭子样品按照Universal Genomic DNA Kit说明书提取DNA，将提取的DNA标准化为100 mg/L，以此为模板进行RT-PCR。采用实验室先前制备的阳性质粒，梯度稀释制作标准品，RT-PCR扩增制作标准曲线。本试验所用的检测引物：5′-CACGAGCACCTCCAAAGA-3′；5′-TTGTACCCGTCGCAGA-GGAT-3′。反应体系：PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，模板2 μL，RNase Free dH2O补足至20 μL。反应程序：50℃ 2 min;95℃ 2 min，95℃变性15 s，60℃退火1 min，40个循环；反应完成后进行融解曲线分析，每个样品设3次重复。根据标准曲线和样品Ct值，计算病毒载量。

2 结果

2.1 标准曲线的建立用NanoDrop 2000测定质粒浓度，经公式计算质粒的拷贝数为4.21×1010拷贝/μL，将质粒按照(4.21×103～4.21×107拷贝/μL)5个梯度稀释，进行实时荧光定量PCR扩增，以标准品的拷贝数作为横坐标，对应的Ct值作为纵坐标，制作标准曲线(图1)，线性方程为y=-3.301x+38.095，斜率为-3.301，y轴截距为38.095，相关系数为1，表明线性很好。

图1 标准品线性回归曲线

2.2 SPF鸡接种FAdV-4后组织器官病毒载量的动态分布通过RT-PCR检测组织器官中FAdV-4的拷贝数(以对数值表示)，结果显示所有的组织器官在感染后1 d便能够检测到病毒。在感染后1～21 d，病毒在不同组织器官中的分布和含量存在差异，但整体趋势都是先增加后减少，感染后5～6 d达到最大值，其中肝脏、心脏和肺脏中病毒含量较高，肝脏中的病毒载量高达108拷贝/μL，表明肝脏是FAdV-4的主要靶器官;肺脏和心脏中的病毒载量约为106拷贝/μL。脾脏、胸腺、法氏囊3种免疫器官在感染后6 d达到最大值，病毒载量为104～106拷贝/μL。腺胃、胰腺和肾脏的病毒载量呈规律性变化，分别在在感染后5、6 d达到最大值，而后降低。与其他组织器官相比，肌肉和脑中的病毒载量较低，最大值仅为104拷贝/μL。在感染后6～21 d 组织器官中的病毒载量逐渐下降，在感染后21 d 组织器官中的病毒载量很低，小于100 拷贝/μL(图2)，整个试验过程对照组未检到病毒。

图2 FAdV-4感染SPF鸡不同时间点各组织器官的病毒载量

2.3 SPF鸡接种FAdV-4后体外排毒规律SPF鸡感染后1～21 d咽喉和泄殖腔棉拭子中均可以连续检测到病毒，咽喉中的排毒量波动不大，甚至在感染后14～21 d仅有微量排毒，主要通过泄殖腔排毒。咽喉和泄殖腔的整体排毒趋势较为一致，在感染后6 d咽喉和泄殖腔的排毒均达到最大值，其中泄殖腔的病毒载量高达6.6×104拷贝/μL，感染6 d 以后排毒量开始下降，到21 d时排毒量很低(图3),对照组棉拭子未检测到病毒。

图3 FAdV-4感染SPF鸡的咽喉拭子和泄殖腔拭子的排毒情况

3 讨论

近年来，FAdV-4在我国多个省份暴发，主要感染3～6周龄的肉鸡[16]，病程多呈急性经过，死亡率可高达80%[25]，目前发现种鸡、蛋鸡和杂交鸡也可感染该病[13]，也有少数报道鹅、鸭子、鹌鹑和鸳鸯也可感染此病毒[26-29]。前人研究发现，鸡感染该病毒后可通过水平和垂直方式传播[20]，传染性很强，因此对其传播途径、传播规律及感染动物体内分布的研究显得尤为重要。

组织器官病毒载量的动态分析发现，SPF鸡感染FAdV-4后，所有的组织器官均能够连续的检测到病毒，并且在感染后1 d，检测到病毒，说明FAdV-4能迅速分布到鸡组织器官中，甚至在感染后21 d，仍然能够在SPF鸡的各个组织器官中检测到FAdV-4，说明FAdV-4可以在SPF鸡体内持续存在较长时间。脾脏、胸腺和法氏囊3种免疫器官的病毒载量在攻毒后1～6 d呈上升趋势，在第6天达到最高，病毒载量从高到低分别为脾(6.27)、法氏囊(5.31)、胸腺(5.12)。表明脾脏是抗感染免疫的主要免疫器官。感染后6 d正是病毒感染的高峰期，病毒迅速入侵免疫器官，并在免疫器官中增殖，使免疫器官受到侵害，免疫功能紊乱，进而容易激发或者并发其他细菌、真菌或其他病毒病，导致死亡，这可能是鸡感染FAdV-4后具有较高死亡率的原因，与先前的研究结果一致[30]。本研究首次发现，FAdV-4存在于SPF鸡的脑中，表明FAdV-4可以穿过血脑屏障，入侵脑并在脑中复制。但在试验中并未观察到SPF鸡有明显的神经症状，因此FAdV-4是否能够穿过血脑屏障，破坏中枢神经系统需要更进一步的研究。此外，在肌肉中也有病毒的分布，表明FAdV-4可以在肌肉中复制，虽然病毒载量相对于其他组织器官较低，但是推测病毒的复制会破坏肌肉组织，从而导致鸡感染后出现蜷缩、不愿移动等症状。本试验中FAdV-4在SPF鸡的各个组织器官中分布的部位和含量存在差异，但整体趋势都是先上升后下降，相同时间点肝脏中的病毒含量要高于其他组织器官，说明肝脏是FAdV-4的主要靶器官，这与前人的研究结果一致[14,31]。在感染6 d以后组织器官的病毒载量持续降低，表明SPF鸡体内的免疫作用对FAdV-4的增殖起到了抑制作用。试验中所采集的组织器官参与了鸡体内各大系统的运行，包括消化系统(腺胃、肝脏、胰腺)、呼吸系统(肺脏)、血液循环系统(心脏)、免疫系统(脾脏、胸腺、法氏囊)、神经系统(脑)、泌尿系统(肾脏)等，FAdV-4感染SPF鸡后可入侵多个组织器官，从而影响机体的各项生命活动。

感染后FAdV-4 SPF鸡的咽喉和泄殖腔均能够连续检测到病毒，表明SPF鸡在感染后可通过呼吸道和泄殖腔这两种方式进行排毒。感染后1 d在泄殖腔和咽喉拭子中可以检测到病毒，咽喉中病毒的含量要比泄殖腔的含量高，推测与接种方式为滴鼻点眼有关。病毒在感染后1 d便能够迅速通过呼吸道和泄殖腔排出体外，提示一些免疫学上的应用，宿主接种疫苗后，FAdV-4迅速排出体外，然后通过消化道和呼吸道进入鸡体内，可以诱导鸡的黏膜免疫系统(mucosal immune system,MIS)产生免疫反应，加强对宿主的免疫作用。在感染后5 d排毒量最高，排毒量与组织器官的病毒载量的变化趋势相同。泄殖腔排出的病毒可以污染饮用水和饲料，从而使病毒通过粪口传播。咽喉虽然检测到的排毒量较低，但病毒可通过呼吸释放到空气中，通过呼吸道进行传播。通过这些结果发现FAdV-4感染SPF后可通过呼吸道和泄殖腔释放病毒，导致饲养环境被污染，推测这应该是该病毒传染性较高的原因。直至试验结束，试验组的SPF鸡仍然能够通过呼吸道和泄殖腔排毒，因此应在本试验基础上适当延长排毒检测的时间，掌握感染鸡的排毒规律，有助于该疾病的防控。

本试验将FAdV-4人工感染SPF鸡，对感染后1～21 d SPF鸡的咽喉、泄殖腔和各个组织器官中的病毒含量和分布进行全面系统的动态监测，发现病毒可以通过呼吸道和泄殖腔释放病毒，其排毒量存在差异，泄殖腔的排毒量要高于呼吸道，但可以肯定的是，FAdV-4的广泛感染与呼吸道和泄殖腔病毒的释放密切相关，这也为预防该病的传播提供了一个有效的措施。此外，在感染后21 d，剩余鸡群已无明显的临床症状，但是仍然能够检测到病毒，表明耐过的鸡群仍然携带病毒，这显然增加了防控FAdV-4的难度。由于感染FAdV-4后SPF鸡通过呼吸道和泄殖腔进行排毒，为病毒的水平传播提供了良好的条件，这提示在生产中，暴发过FAdV-4的养禽场应做好全面的消毒，鸡群不宜留作种用，防止病毒的垂直传播。