我国部分地区羊肠道隐孢子虫、毕氏肠微孢子虫和芽囊原虫的分子流行病学

郑 玲，王朋林，陈凯丽，刘林科，王荣军，张龙现，宁长申，菅复春 (河南农业大学 牧医工程学院,河南 郑州 450002)

养羊业是我国畜牧业的重要组成部分，近年来，随着我国经济的发展，人民生活水平的提高，羊肉及其与羊有关的副产品需求量及质量也随之增加[1]，加上近年非洲猪瘟肆虐，肉羊产业迎来了新的发展机遇。同时也面临着饲养管理及疫病防控等方面的挑战。隐孢子虫、芽囊原虫、毕氏肠微孢子虫是3种常见的机会性致病原虫，也是威胁羊的健康和养殖经济效益的关键因素之一。同时，这3种虫均有人兽共患种类或基因型，可致人出现如腹泻、腹痛、呕吐等各种胃肠道症状。为了解我国羊肠道原虫病原的种类与基因型，本研究对我国部分地区羊肠道隐孢子虫、芽囊原虫、毕氏肠微孢子虫感染情况进行调查，以期为我国羊肠道原虫病、人兽共患病的防控提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 样本来源2017年6月—2018年12月对河南、陕西、辽宁、内蒙古、贵州、新疆6省放牧或舍饲羊群随机采集粪便样品935份，其中陕西68份、河南292份、辽宁35份、内蒙23份、贵州108份、新疆409份。每份样品采集10～20 g，采集后保存于洁净自封袋中，记录其采集地点、采样时间、临床症状等样品信息。将采集好的样品带回实验室，保存于4℃冰箱备检。

1.2 PCR检测参照OMEGA粪便全基因组 DNA 提取试剂盒说明书提取样品DNA，采用巢氏PCR方法对样品分别进行隐孢子虫、毕氏肠微孢子虫和芽囊原虫检测。参考肖立华等[2]扩增隐孢子虫基于SSU rRNA基因的引物和反应条件对隐孢子虫进行PCR扩增，目的片段为830 pb。基于ITS基因对毕氏肠微孢子虫进行PCR扩增[3]，目的片段大小约为389 bp。基于SSU r RNA基因对芽囊原虫进行单轮PCR扩增[4]，目的片段约为600 bp。将最后1轮PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳、凝胶成像系统观察，并拍照记录。

1.3 3种原虫病原的基因型鉴定分别基于隐孢子虫、芽囊原虫SSU r RNA、毕氏肠微孢子虫ITS基因进行巢氏PCR扩增，产物使用紫外凝胶成像分析系统观察和拍照，根据凝胶电泳结果，将与阳性对照片段大小一致的第2轮PCR产物委托北京擎科生物科技有限公司测序。对阳性样品序列经 GenBank同源搜索、ClustalX 2.13软件比对确定病原种类和基因型。

2 结果

2.1 羊隐孢子虫感染情况及虫种鉴定通过PCR检测法，发现羊隐孢子虫的总感染率为 5.6%(52/935)，其中河南隐孢子虫感染率最高，为16.8%(49/292)。陕西、辽宁的感染率分别为1.5%(1/68)和5.7%(2/35)。贵州、内蒙、新疆3地采集的样品中均未检出隐孢子虫。52个阳性样品经测序分析后共发现3种隐孢子虫种，分别为肖氏隐孢子虫(C.xiaoi，n=20)、泛在隐孢子虫(C.ubiquitum，n=28)和微小隐孢子虫(C.parvum，n=4)。河南有3种隐孢子虫，陕西1种为泛在隐孢子虫，辽宁鉴定出1种为肖氏隐孢子虫(表1，图1)。

M.DL2000 DNA Marker；1～22.样品；P.阳性对照；N.阴性对照

表1 不同地区羊隐孢子虫的感染情况

2.2 羊芽囊原虫感染情况及基因亚型鉴定通过对935份样品芽囊原虫的SSU rRNA基因扩增，共有112份成功扩出长度约600 bp的目的基因。芽囊原虫总感染率为 12.0%(112/935)，其中内蒙古芽囊原虫感染率最高为39.1%(9/23)。河南、贵州、陕西、辽宁芽囊原虫的感染率分别为31.5%、4.6%、7.4%和2.9%，而新疆样品未检出芽囊原虫。112个阳性样品经测序分析，共鉴定出6种芽囊原虫亚型，其中河南有5种，分别为ST10、ST1、ST4、ST5和ST14，贵州有ST10、ST6 2种亚型，陕西则为ST10、ST14 亚型，内蒙古流行ST10、ST5 两种亚型，辽宁仅鉴定出ST10亚型(表2,图2)。

表2 不同地区羊芽囊原虫的感染情况

M.DL2000 DNA Marker；1～9：样品；P.阳性对照；N.阴性对照

2.3 羊毕氏肠微孢子虫感染情况及基因型鉴定经毕氏肠微孢子虫的SSUr RNA基因内部转录间隔区(ITS)的PCR法检测发现，羊毕氏肠微孢子虫的总感染率为35.0%(324/935)。通过序列比对分析，共检测出11种已报道基因型，分别为BEB6、CDE13、CHC8、CHD3、CHG1、CHG3、CHG5、COS-I、EbpC、I、OEBI。各地区具体感染毕氏肠微孢子虫情况见表3、图3,4。

M.DL2000 DNA Marker；1～22.样品；P.阳性对照；N.阴性对照

▲：为本研究中确定的部分序列

表3 不同地区羊毕氏肠微孢子虫的感染情况

3 讨论

3.1 隐孢子虫本研究中隐孢子虫的总感染率为5.5%(52/935)，低于此前报道的我国青海羊隐孢子虫感染率(12.3%)[5]，但与西澳大利亚(6.5%)[6]以及我国甘肃(4.5%)[7]、安徽(5.8%)[8]、郑州(3.26%)[9]感染率相似，本次调查在新疆未发现隐孢子虫感染，而QI等[10]对新疆羊隐孢子虫感染调查发现该虫感染率为0.9%。不同养殖模式下，山羊隐孢子虫感染存在差异[11]，感染率的差异可能与羊的饲养环境和检测方法等因素有关。因此，未来需要开展更多分子生物学研究，以便深入了解羊隐孢子虫的传播特征。本研究共鉴定出3种隐孢子虫虫种：肖氏隐孢子虫、泛在隐孢子虫和微小隐孢子虫，这一结果与此前齐萌等[10]对新疆地区调查的结果一致。LI等[5]在对青海绵羊的调查发现肖氏隐孢子虫和泛在隐孢子虫。本研究中河南地区羊隐孢子虫感染率最高，且发现3种隐孢子种，其中微小隐孢子虫和泛在隐孢子虫具有人兽共患性。提示应加强羊场粪污管理，防止粪便污染环境而导致人的感染。

3.2 芽囊原虫芽囊原虫是寄生在人和多种动物肠道、分布广泛的一种厌氧型真核微生物[12]。本次调查发现5个地区羊群有芽囊虫感染，总感染率为12.0%(112/935)。DENG等[13]、XIAO等[14]分别在世界上首次报道我国四川大熊猫和湖北恩施复齿鼯鼠芽囊原虫感染情况(表4)。伊朗ASGHARI等[15]首次报道在乌鸦和鸽子粪样检测并鉴定出芽囊原虫，感染率分别为44.4%和42.9%。顾有方等[16]对安徽省及周边地区羊人芽囊原虫感染率调查中发现，山羊感染率为0.26%，绵羊人芽囊原虫感染率为6.0%，均低于本次调查的羊芽囊原虫感染率(12.0%)，其绵羊感染率与WANG等[17]报道的我国黑龙江绵羊芽囊原虫5.5%感染率相似。地理环境、季节、样本量、饲养管理方式等都会影响肠道寄生虫的感染与传播。

基于芽囊原虫SSU rRNA 基因核酸差异，至今已鉴别出22个芽囊原虫基因亚型ST1-ST9为人兽共患基因亚型[18]。谢世臣[19]在我国云南省黑山羊中发现3个已知基因型(ST5、ST10、ST14)和4个新基因型(ST-novel1、ST-novel2、ST-novel3 和 ST-novel4)，本研究共发现6种芽囊原虫的基因亚型，包括与上述报道相同的ST5、ST10、ST14 3个基因亚型和ST1、ST4、ST6亚型。本次调查，河南、贵州、内蒙古的羊粪样中共发现ST1、ST4、ST5、ST6 4个人兽共患亚型。因此，相关地区应加强公共卫生宣传，提高羊养殖从业人员的自我防护意识，防止人兽共患原虫病的传播(表4)。

表4 2018-2019年人和动物芽囊原虫感染种类和亚型分布

3.3 毕氏肠微孢子虫毕氏肠微孢子虫是人和多种动物肠道内寄生的人兽共患原虫[20]。在世界范围内，关于羊毕氏肠微孢子虫的报道较少，巴西[21]和泰国[22]羊毕氏肠微孢子虫的感染率相同，均为19.2%，明显低于本次调查的感染率(34.7%)，但高于杜海利等[23]调查的河南羊毕氏肠微孢子虫9.23%。毕氏肠微孢子虫基因型经系统发育分析可划分为9个组，其中Group1具有人兽共患性，是9个进化组中感染宿主范围最广的一个。其余8个组群具有宿主特异性。羊主要感染Group2中的基因型[24]。本研究中共发现11种已知的基因型，分别为BEB6、CDE13、CHC8、CHD3、CHG1、CHG3、CHG5、COS-I、EbpC、I和OEBI、其中，BEB6为优势基因型。为鉴定本研究中的毕氏肠微孢子虫基因型和已报道虫株的关系，经构建进化树分析显示，本研究11种基因型中，Ebpc分布在遗传属于Group1，为人兽共患基因型。EBE6、CHD3、CHG1、CHG3、CHG5、COS-1、I和OEBI属于Group2，具有宿主特异性和潜在人兽共患性。BEB6也是羊上常见的基因型，该型宿主范围范围广，既可感染人，也可感染动物，具有潜在的人兽共患性。据以往对西藏地区羊的毕氏肠微孢子虫，鉴定出12种基因型[38]。其中也同样包括 BEB6 在内 5个已知基因型和8个新基因型。

通过对我国6省区12个养殖场的羊肠道寄生虫检测发现，我国羊肠道寄生虫感染普遍存在。经基因分析发现，隐孢子虫、芽囊原虫、毕氏肠微孢子虫3种原虫中均有人兽共患种类或基因型/基因亚型。为保障公共卫生安全，应在加强对羊只饲养管理的同时，还要提高从业人员对寄生虫感染和危害的认识，做好自身防护，避免人兽共患病的发生，保障经济和社会效益双丰收。