基于GGE双标图和BLUP分析筛选镉砷同步低累积水稻品种

柳赛花，纪雄辉，谢运河，刘昭兵，田发祥，潘淑芳

湖南省农业环境生态研究所/湖南省农业科学院，湖南 长沙 410125

随着经济的发展和城市化进程的加快，镉砷等重金属高含量复合伴生进入土壤系统，严重威胁生态环境和人类健康，2014年全国土壤污染状况调查公报显示全国镉（Cd）和砷（As）点位超标率分别为7.0%和2.7%。Cd是一种生物蓄积性强、毒性持久、具有“三致”作用的剧毒元素，摄入过量镉对人体危害极其严重He et al.（2013）。As是一种慢性毒性的类金属，通过食物与饮用水暴露途径对人体健康产生影响，长期接触砷可以导致肺损伤、外周神经损伤、皮肤病或心血管病，是引起多种癌症的因素之一（Abernathy et al.，1999）。水稻具有富集重金属Cd的特点，是吸收Cd能力最强的大宗谷类作物之一（Chaney et al.，2004），且水稻也是中国受As污染的主要粮食作物之一，如中国人均As摄取量约为 42 μg·d-1，中国成年男子的膳食中总As的摄人量远远高于美国、加拿大和澳大利亚等国家，其中通过大米摄人的As占总As摄人量的60%（Li et al.，2011），较高的稻米镉砷含量使得以稻米为主食的居民健康受到严重威胁（Stroud et al.，2011；Zhou et al.，2018）。

大量报道认为，不同的水稻品种对Cd、As的吸收和累积能力存在显著差异（Chen et al.，2018；Duan et al.，2017），目前国内外水稻镉砷低吸收品种筛选与遗传改良的研究较多，有研究表明水稻镉砷低吸收品种能有效降低稻米镉20%—50%，在镉污染土壤中种植低镉水稻品种能使稻米镉含量低于国家限量标准（0.20 mg·kg-1）（Mu et al.，2019），在孟加拉等地的300多个水稻品种大田试验中，筛选出了76个砷低累积品种（Norton et al.，2012），可见应用重金属低累积水稻品种已是目前控制水稻镉或砷吸收累积的有效措施之一（单天宇等，2017）。在镉砷复合污染土壤环境中，由于镉砷不同的化学性质，使得稻米镉砷含量呈负相关关系（Duan et al.，2017），但因稻米镉砷含量除了受品种影响外，环境对稻米镉砷含量影响至关重要，占稻米镉砷差异来源的87%（Chi et al.，2018），从而使得稻米镉砷同步低累积存在可能。因此本研究选取湖南省浏阳七宝山矿区典型镉砷复合污染稻田土壤，利用基因型主效加基因型-环境互作效应（GGE）双标图分析了 18个湖南省应急性镉低累积水稻品种的镉砷低累积性、稳定性、适应性和环境相关性，利用最佳线性无偏预测（BLUP）法计算不同品种稻米镉砷含量育种值，为筛选镉、砷及镉砷同步累积水稻品种提供一种新方法，为镉砷同步低累积水稻品种的选育及推广提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验品种

试验1、2、3中的品种为湖南省应急性镉低累积水稻品种，总计18个，具体名称见表1。

表1 试用所用的水稻品种Table 1 Directory of cultivated rice cultivars

1.2 试验地点和试验设计

试验 1：在湖南省农业科学院内网室进行，采用盆栽试验，每一品种设置为一个处理，18个品种即为18个处理，每个处理5个重复。选用直径约为15 cm的塑料桶，共计80桶，每桶装5 kg土壤，供试土壤采自湖南省浏阳市永和镇佳成村，为花岗岩发育的麻砂泥0—20 cm耕层水稻土，肥料分别为尿素、磷酸钙和氯化钾的形式按N—P—K以150—90—135 kg·hm-2的量加入，加入肥料充分混匀随机区组排列，设置保护行加自来水浸泡7 d后种子直播，2周后追施一次尿素，用量为N 0.08 g·kg-1灌溉使用自来水，其 pH 6.91，重金属镉含量未检出。水分管理采取分蘖末期和成熟期2次晒田，病虫害防治与大田相同。

试验 2：在浏阳永和镇的镉砷污染稻田开展早稻季大田试验（28°29′N，113°89′E）。于 3 月 23 日育秧，4月19日移栽，根据不同品种的成熟时间于7月4日—8月9日收获。采用随机区组设计，每小区为一个品种，6行10列，每个品种3个小区重复，且周边设置0.5 m的保护行。水分管理采取分蘖末期和成熟期2次晒田，肥料管理按照当地管理方式进行。

试验 3：在浏阳永和镇的镉砷污染稻田开展晚稻季大田试验。于6月12日育秧，7月3日移栽，根据不同品种的成熟时间于9月18日—10月10日收获。随机区组设计及水肥管理同试验 2。3个试验的土壤pH和镉砷含量见表2。

表2 试验土壤的pH土壤镉砷含量Table 2 pH and contaminant concentrations of soil inpot experiment and field sites

1.3 样品处理和测定

水稻于成熟期取样，稻谷经晒干后去壳粉碎，过100目尼龙筛待测。稻米中总镉和总砷测定采用微波消解，称取0.5000 g植物样品，加入5 mL HNO3和2 mL H2O2，利用微波消解仪消解，超纯水定容至100 mL，用ICP-MS测定总Cd、As浓度。样品分析中所用试剂均为优级纯，并添加国家标准参比物质（大米：GSB-22）为内标进行质量控制，分析器皿均以5%硝酸溶液浸泡过夜，以去离子水洗净。

1.4 数据统计与处理

试验数据用Excel 2007和SPSS 19.0进行统计分析和作图，采用GGE-Biplot分析水稻品种的低镉砷累积能力和稳产性，采用ASReml计算每个品种关于镉和砷的育种值。

2 结果与分析

2.1 不同品种稻米中镉砷含量

从3个试验来看，均是稻米镉含量高于稻米砷含量，且稻米镉砷含量呈显著负相关关系，-0.10（试验1）、-0.09（试验2）、-0.36（试验3）。从表3中可以看出，试验1和试验2、3中稻米镉砷含量差异明显，试验1、试验2和试验3中稻米镉砷含量的算术平均值为 1.61、1.33 mg·kg-1，1.45、0.50 mg·kg-1与 1.13、0.15 mg·kg-1。不同水稻品种中镉砷含量差异显著，试验1、试验2和试验3的品种间稻米镉砷含量变幅分别为21.1、12.8倍，1.7、3.7倍与2.4、9.0倍，其变异系数分别为1.0和1.0、0.3和0.2与0.3与0.1。

表3 3个试验的稻米镉砷含量Table 3 Heavy metal concentrations in different cultivars of rice grains in 3 tests

方差分析结果表明（表4），品种、环境及品种与环境互作对稻米镉砷含量影响都达到极显著水平。在盆栽和大田试验的方差分析来看，稻米镉差异来源主要受品种与环境互作的影响，占总影响的45.4%，稻米砷差异主要受环境和品种与环境互作的影响，分别占总影响的39.8%和33.6%。从早晚季试验的方差来看，品种、环境及品种与环境互作对稻米镉含量的影响均大，分别为 32.4%，24.1%和25.7%，而稻米砷的主要差异受环境影响较大，占整体影响的59.9%。

表4 稻米镉砷含量差异方差分析Table 4 Analysis of variance for grain Cd and As concentrations from 18 rice cultivars grown at pot and field in two seasons

2.2 品种稻米镉砷低累积能力及其稳定性

图1中的小圆圈代表平均环境，通过原点和平均环境且带箭头的直线为“平均环境轴”。“平均环境轴”的箭头所在的位置代表品种在所有环境下稻米镉或砷的近似平均含量，越往箭头方向含量越低；与平均环境轴垂直并通过原点的直线代表各品种与各环境相互作用的倾向性，越偏离“平均环境轴”越不稳定。以“平均环境轴”上的箭头为圆心画圆，越靠近中心圆的品种，其稻米镉砷低累积能力越强且越稳定。由图1可以看出，稻米镉低累积能力和稳产性较好的品种为14，其次是15和9等，表现比较差的品种为10、13和8等。稻米砷低累积能力和稳产性较好的品种为9，其次是14、17等，表现比较差的品种为5、1和12等。

图1 GGE双标图分析品种的稻米镉砷低累积能力及其稳定性Fig. 1 The comprehensive ranking view of the GGE biplot for rice cultivars

2.3 不同品种的适应性

将最外面的品种顺序连接起来形成一个多边形，过原点向各个边做垂线，这样多边形就被分成多个扇形区域，多边形的顶点为所在区域表现最好的品种，而位于多边形内、靠近原点的品种是对环境变化不敏感的品种，蓝色圆圈是根据环境进行生态型划分。图2可以看出，GGE双标图的PC1和PC2可以有效的解释G（基因）和GE（基因×环境）互作的对镉砷影响94.75%和99.65%的变异，可以解释绝大部分的变异，具有较强的代表性。对镉而言，3个环境整体分为一个生态型，而品种14是该生态型中表现最好的品种。对砷而言，3个环境整体分为3个生态型，品种4是环境2表现最好的品种，品种9是环境1表现最好的品种。

图2 GGE双标图分析品种的适应性Fig. 2 Adaptability view of the GGE biplot for rice cultivars

2.4 试验环境的相关性

环境相关性评价可以直观的分析各试点对品种评价的相似性，连接原点和各环境的直线称为向量，两环境向量夹角的余弦值近似于它们的遗传相关系数，夹角越小说明环境对于参试品种的排序越相似，夹角小于90度为正相关，大于90度为负相关。环境之间不相关或者负相关表示这些环境属于不同的类型区，因此，根据稻米镉和砷含量的环境相关性评价可以看出（图3），环境2和环境3夹角较小，生态比较相似属于同一区域，环境1为另一区域。

图3 GGE双标图分析环境相关性Fig. 3 Envrionment vector view of the GGE biplot for rice cultivars

2.5 品种镉砷的综合育种值

根据表5中稻米镉砷含量的最佳线性无偏预测（BLUP）值可知，稻米镉含量育种值排名前5的品种分别为 14＞15＞9＞8＞16，稻米砷含量育种值排名前 5的品种分别为 9＞7＞14＞16＞13，稻米镉砷含量综合育种值排名前5的品种分别为14＞9＞15＞16＞8。

表5 不同品种稻米镉砷BLUP值Table 5 Cadmium and arsenic BLUP values of different rice cultivars

3 讨论

在重金属污染稻田种植低累积水稻品种是中国农田粮食安全生产的一项有效措施，但不同品种稻米镉砷含量差异很大，如Duan et al.（2017）报导在中国华南地区471个当地主栽高产品种稻米镉砷含量差异达32、4.0倍，Mu et al.（2019）发现在中国四大粮食产区总计687个大米样品的稻米镉砷含量差异分别为 0.004—1.38、0.011—0.235 mg·kg-1，这为中国受污染耕地水稻安全生产提供大量镉砷低累积水稻种质资源。

一般而言，水稻品种稻米Cd/As含量差异与水稻生长发育过程中Cd/As吸收转运迁移的难易程度不同有关，水稻Cd/As吸收转运通道和路径的不同均会造成不同水稻品种 Cd/As吸收累积差异（Ishimaru et al.，2012；Kamiya et al.，2013），另外，稻米Cd/As含量易受土壤pH、土壤Cd有效态含量、水分含量等环境影响（Cao et al.，2014；Li et al.，2018），多点试验证明环境不仅对水稻产量影响至关重要，对稻米镉砷含量影响也很大（Mu et al.，2019），Chi et al.（2018）研究表明年度降雨不均衡会造成早稻镉含量低于晚稻稻米，而早稻稻米高于晚稻稻米。何洋等（2016）研究表明温度是影响水稻籽粒镉积累的重要因子，不同生育时期温度变化导致糙米镉含量的变化。从本研究稻米镉砷含量差异分析结果看出，在盆栽和大田环境差异较大的情况下，稻米镉差异主要受环境与品种交互作用影响，占总影响的45.4%，而稻米砷则更易受环境影响，占39.8%。因此借助一定的数学模型方法综合评价品种、品种与环境交互作用对稻米镉砷低累积能力及其稳定性影响，进而得到镉、砷和同步镉砷低累积品种用于指导中轻度重金属污染稻田的安全生产具有重要意义。

目前对于低累积品种的确定，主要是通过盆栽筛选、多点大田筛选和不同地区大田验证，根据各试验点平均镉含量、超标试验点数和重复次数综合评价方法进行低累积品种评价（张玉烛等，2017），GGE模型是同时考虑基因型效应和基因与环境互作效应的模型，它使用双标图的形式展示基因与环境互作，提供鉴别品种高产和稳产性及品种的环境适应性分析。目前主要用于水稻（王磊等，2015）、花生（郭敏杰等，2017）、玉米（孟令聪等，2019）、大豆（昝凯等，2019）和大麦（赵锋等，2019）等品种的区域丰产优质、稳定性及适应性的评价，显少用于对水稻品种镉砷低累积能力及其稳定性的评价，鉴于 GGE本身针对的是表型数据高的品种筛选，因此本研究通过对不同品种稻米镉砷含量数据进行标准化处理并负数化的数据转化后，分析得出稻米镉低积累品种为 14、15、9，稻米砷低累积品种为9、14、17。GGE分析提供图形直观地表达，可帮助我们分别评价参试品种稻米低镉或低砷累积能力及其稳定性，但不能综合多个性状同时评价，另外品种数量和点位数量较多的情况下，图形中的点位和品种数据可能重叠而影响其评价判断。因此在多性状同时评价的情况下，在计算单一性状BLUP值的基础上，运用综合BLUP值进行评价。BLUP法具有估计值无偏、估计值方差最小、可消除因选择和淘汰等原因造成的偏差等特性，是当今世界范围内主要的种畜遗传评定方法（李晶等，2020；郑聪慧等，2019），暂无用于对水稻稻米镉砷低累积能力遗传评价，本研究通过计算稻米镉和砷含量单一性状的BLUP值，稻米镉和砷含量单一性状各赋予一个权重 0.5，计算出稻米镉砷含量综合BLUP值，根据其排名可直接得出稻米镉砷含量同步低累积的品种，最优的同步低累积品种为品种14，其次是品种9，和GGE模型评价的结果基本一致。本研究3个试验点的地点一个为盆栽，另外两个为早稻季和晚稻季相邻大田，虽然本研究中的试验地点代表性有待加强，但通过 GGE双标图和BLUP分析多环境试点中品种的镉砷低累积能力及稳定性和筛选多环境试点的镉、砷及镉砷同步累积水稻品种是一种可行的新方法。

4 结论

3个试验中稻米镉砷含量差异显著，稻米镉含量为 0.20—4.21mg·kg-1，稻米砷含量为 0.03—4.24 mg·kg-1，稻米镉差异来源主要受品种与环境互作的影响，稻米砷受环境影响较大。通过 GGE双标图筛选出适宜不同环境种植的低镉品种和低砷品种分别是品种14（Y两优19）、15（深两优5814）和9（晶两优华占），稻米砷低累积品种为品种 9（晶两优华占）、14（Y两优19）和17（望两优5511），进一步通过BLUP分析得出镉砷同步低累积品种为品种14（Y两优19）和9（晶两优华占），和GGE模型评价的结果基本一致。总的来说，利用 GGE双标图和BLUP分析筛选多环境试点中的镉砷低累积水稻品种，可为重金属污染耕地水稻品种选择提供科学依据。