不同浓度植物根系分泌物微生态效应研究

沈凤英 ，吴伟刚，李亚宁，刘大群 ，滕云

1. 国家北方山区农业工程技术研究中心/河北省植物病虫害生物防治工程技术研究中心/河北农业大学植物保护学院，河北 保定 071001；2. 河北北方学院农林科技学院，河北 张家口 075000；3. 中国农业科学院研究生院，北京 100081

植物在生长过程中由根系不同部位分泌产生的无机离子或小分子有机物统称为根系分泌物（何为等，2017；章帆等，2018；尹华军等，2019）。根系分泌物的产生是植物在长期进化和生长过程中形成的一种适应机制。根系分泌物的产生受外界环境的影响，而根系分泌物本身对根际环境具有改变作用（蒋铮等，2018；刘小明等，2018）。关于植物根系分泌物的研究已有200多年历史。Syrennius早在1768年就提出植物根系能分泌某种物质；随后，Plenk（1795年）和Decardolle（1830年）观察到根系分泌物对邻近植株有促生和抑制作用。20世纪50年代，有研究揭示了根系分泌物的作用；到20世纪70年代，根系分泌物的研究出现了蓬勃发展的趋势。近年来的研究表明，根系分泌物是保持根际生态系统活力的关键因素，也是根际微生态系统中物质迁移和调控的重要组成部分（Tian et al.，2019；Zhang et al.，2019；María et al.，2020）。

根系分泌物是健康植株在一定生长状态下，由根系通过分泌或溢泌作用释放到根际环境中的具有一定溶解性有机物的总称，是植物与外界环境之间进行物质、信息交流的重要载体和通讯物质（刘艳霞等，2016；王婷等，2018；张文明等，2018；字淑慧等，2019）。常作为化感物质影响植物根际土壤微生物群落结构和数量、土壤酶活性及理化性状等，进而影响植物生存环境的物理、化学和生物学性状（Chang，2019；Holz et al.，2019；Lv et al.，2020）。土壤中的微生物是生态系统养分转化和循环的动力，其潜在的生物化学活性对土壤发挥其生态功能有重要意义；同时，由于植物根系的分泌物中包含有大量的有机物质，为土壤中的微生物提供了碳源，使得土壤中的微生物群落组成及数量不同于根外土壤，而土壤微生物直接参与土壤中氮、磷等养分物质的循环和转化，它的代谢产物也影响着植物的定植、生长、繁殖和群落演替，因而土壤微生物的数量和种类构成对评价土壤养分和肥力状况有重要意义（王吉秀等，2016；孙燕等，2017；王婷等，2018）。目前，国内外关于根系分泌物的研究主要集中在农作物连作障碍、农田肥力、重金属污染等农业领域，而对园林植物根系分泌物及其生态功能的研究相对较少（唐希望等，2018；张建聪等，2019）。本研究以夹竹桃（Nerium oleander）为对象，通过水培法收集种植物的根系分泌物，将收集的分泌物原位土壤培养。分析其对土壤理化性质、土壤微生物群落功能多样性、微生物量碳、微生物熵、基础呼吸和代谢熵的影响，以期为深入揭示园林植物根系分泌物的形成机理，为园林植物的大力推广提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

园林植物选择夹竹桃（Nerium oleander）（城市道路长势较好的100株夹竹桃，高度约为3 m），将采集到的夹竹桃根系清洗干净后置于Hoagland完全营养液中复性3 d（增氧泵通气）。复性后的根系用1% NaClO消毒15 min，用无菌水冲洗干净后定植于1000 mL的烧杯中，加无菌水使根部全部浸没。在室温条件下分别培养6、12、24 h后将根系取出（记录液体体积），烧杯中的液体即为夹竹桃根系不同收集时间段的分泌物收集液。收集液经过滤后，减压浓缩10倍后低温密封保存。同时采集夹竹桃根区新鲜土壤，4 ℃保存后用于测定土壤微生物特性。

1.2 根系分泌物回接土壤

分别取上述根系分泌物浓缩液10 mL，加入80 g过1 mm筛的原位土中，置于100 mL螺口玻璃瓶中，密封，于25 ℃恒温培养箱中避光培养3周。试验共设4个处理[低浓度LC为5 mL分泌物+10 mL去离子水；中浓度MC为10 mL分泌物+5 mL去离子水；高浓度HC为15 mL分泌物；并以15 mL去离子水作为对照(CK)]，每种处理设3次重复。

1.3 土壤有机碳、微生物量碳及基础呼吸测定

土壤有机碳（SOC）采用重铬酸钾外加热法测定。在外加热的条件下（油浴温度为180 ℃，沸腾5 min），用一定浓度的重铬酸钾-硫酸溶液氧化土壤有机质（碳），剩余的重铬酸钾用硫酸亚铁来滴定，从所消耗的重铬酸钾量，计算有机碳的含量（谭雪莲等，2018）。

土壤微生物量碳（MBC）采用氯仿熏蒸提取法测定。准确称取相当于烘干土样10 g的新鲜土样，放入真空干燥器中，同时分别放入装有NaOH溶液和无乙醇氯仿的小烧杯，用真空泵抽成真空并保证氯仿沸腾3—5 min，在25 ℃避光黑暗条件下放置24 h（同时设相应未熏蒸对照土样），提取过程浸提液采用 0.5 mol·L-1K2SO4溶液（土液比为 1∶4），并用0.45 μm滤膜抽滤，滤液中碳用High TOC Ⅱ+N（Elementar Ⅱ，Germany）测定。MBC以熏蒸和未熏蒸土样提取液中碳含量的差值 Ec除以转换系数0.45而得到。

土壤基础呼吸（BRC）采用培养法测定。称取相当于20 g干土的新鲜土壤放入培养瓶中，调节土壤含水量为田间持水量的60%，在25 ℃条件下培养24 h，CO2产生量使用气相色谱仪测定，以单位时间内产生CO2-C的量表示基础呼吸大小。微生物代谢熵为基础呼吸和微生物量碳的比值（王吉秀等，2016；孙燕等，2017；王婷等，2018）。

采用Biolog Eco微平板法进行微生物群落多样性的测定。每块微平板含3组各32孔，其中1孔为不含任何碳源的对照，其余31孔各含有1种碳源和氧化还原染料四氮唑蓝，底物利用后产生氧化还原电势的变化可导致染料颜色发生变化。称取5 g不同处理的土样置于50 mL无菌生理盐水中，180 r·min-1振荡30 min，然后用无菌生理盐水稀释至10倍，通过排孔加样器接种至Biolog微平板上，每孔150 μL，3个重复接种在同一个微平板上。25 ℃恒温培养7 d，每隔24小时用Biolog自动读板仪在590 nm下读数。计算平均吸光度值（AWCD）和多样性指数，选取96 h的平均光密度值进行主成分分析（唐希望等，2018；张建聪等，2019）。

1.4 数据统计与分析

运用Excel 2003和SPSS 17.0进行数据统计和分析，所有数据均为平均值±标准偏差，单因素方差分析检验各处理之间的差异显著性，通过主成分分析法分析土壤微生物群落代谢功能。

2 结果与分析

2.1 根系分泌物对土壤理化性状的影响

根系分泌物不同收集时间根系分泌物回接培养后的土壤养分变化情况见表1。由表可知，根系分泌物回接到土壤中培养3周后，土壤pH值、有机碳、含水量、全氮、碱解氮、速效磷均有较明显变化，而土壤全磷无明显差异（P＞0.05）。土壤pH值变化范围在6.01—7.32之间，其中不同浓度根系分泌物处理pH值显著低于CK（P＜0.05）；不同浓度根系分泌物处理下有机碳、含水量、全氮、碱解氮、速效磷含量显著高于 CK（P＜0.05），其大小表现为 HC＞MC＞LC＞CK。

表1 根系分泌物对土壤理化性状的影响Table 1 Effect of root exudates on soil physical and chemical properties

2.2 植物根系分泌物对土壤微生物数量的影响

由图1可知，不同浓度植物根系分泌物对土壤微生物数量有显著影响，不同浓度植物根系分泌物处理下细菌、真菌、放线菌和微生物总数均显著高于对照（P＜0.05），不同处理之间差异均显著（P＜0.05），其大小表现为 HC＞MC＞LC＞CK。

图1 植物根系分泌物对土壤微生物数量的影响Fig. 1 Effect of root exudates on soil microbial population

2.3 植物根系分泌物对土壤微生物学特征的影响

由图2可知，不同浓度植物根系分泌物对土壤微生物学特征有显著影响，不同浓度植物根系分泌物处理下微生物量碳、微生物熵和基础呼吸均显著高于对照（P＜0.05），不同处理之间差异均显著（P＜0.05），其大小表现为HC＞MC＞LC＞CK。土壤代谢熵表现为HC＞MC＞LC＞CK，HC和MC差异不显著（P＞0.05）。

图2 植物根系分泌物对土壤微生物学特征的影响Fig. 2 Effect of root exudates on soil microbial characteristics

2.4 土壤微生物群落代谢平均吸光值变化

由图3可知，随着培养时间的延长，各处理微生物碳源利用总体上呈现逐渐增加的趋势。在 24—72 h内土壤微生物群落AWCD值快速增长，此时微生物活性旺盛，之后则趋于平稳进入平台期，培养至156 h时AWCD又出现小幅度上升。高浓度根系分泌物处理土壤的 AWCD值在整个培养期内均高于对照及其他处理，且在 72 h后幅度明显上升。AWCD值大小顺序为：高浓度＞中浓度＞对照＞低浓度。

图3 土壤微生物群落代谢平均吸光值变化Fig. 3 Changes of mean metabolic absorbance value of soil microbial community

2.5 植物根系分泌物对土壤微生物群落代谢的影响

图4为96 h的平均吸光值计算土壤微生物群落多样性指数。由图可知，不同浓度植物根系分泌物对土壤微生物群落多样性有显著影响，不同浓度植物根系分泌物处理下平均吸光值、物种丰富度指数、Mcintosh指数均显著高于对照（P＜0.05），不同处理之间差异均显著（P＜0.05），其大小表现为HC＞MC＞LC＞CK。不同处理间优势度指数差异不显著（P＞0.05）。

图4 植物根系分泌物对土壤微生物群落代谢的影响Fig. 4 Effect of root exudates on soil microbial community metabolism

2.6 土壤微生物群落代谢功能主成分分析

主成分分析（Principal component analysis，PCA）采取降维的方法，使用少数相互无关的综合指数反映原始数据中所包含的绝大多数信息。对不同处理培养96 h后土壤微生物碳源利用能力进行主成分分析，取第一主成分（PC1）和第二主成分（PC2）做图表征微生物群落的代谢特征（图5）。由图可知，主成分分析中提取的两个主成分因子分别可以解释所有变量方差的43%和32%。CK和中浓度主要分布在PC2轴的正值端，高浓度主要分布在PC2轴的负值端，而低浓度则在正负方向均有分布。4个处理在PC1轴的正负两端均有分布，并未实现很好的分离。由此可见，中浓度根系分泌物处理的土壤与 CK土壤微生物群落代谢特征相近，其明显不同于高浓度根系分泌物处理的土壤，说明它们对单一碳源的利用能力不同，其群落代谢特征存在差异。

图5 土壤微生物群落代谢功能主成分分析Fig. 5 Metabolic function principal component analysis of soil microbial community

不同浓度植物根系分泌物处理下平均吸光值、物种丰富度指数、Mcintosh指数均显著高于对照（P＜0.05），不同处理之间差异均显著（P＜0.05），其大小表现为 HC＞MC＞LC＞CK。不同处理间优势度指数差异不显著（P＞0.05）。主成分分析表明：中浓度根系分泌物处理的土壤与CK土壤微生物群落代谢特征相近，其明显不同于高浓度根系分泌物处理的土壤，说明它们对单一碳源的利用能力不同，其群落代谢特征存在差异。

3 讨论

根系分泌物在改善土壤属性、提高污染物生物可利用性、缓解环境胁迫等方面具有重要作用。一方面，根系分泌的某些胞外酶能够直接参与污染物的降解过程（高雪峰等，2016；易艳灵等，2019；张小全等，2019）；另一方面，分泌物中的可溶性糖、低分子量有机酸、氨基酸等物质，为根际微生物提供充足的营养，增加根际微生物的数量、提高微生物活性，进而加速养分的分解。植物根系土壤理化性状变化是植物对土壤样分的充分吸收、利用，及其适应环境能力的最直接体现（刘海等，2019）。研究结果表明，不同浓度根系分泌物处理pH值显著低于CK（P＜0.05）；不同浓度根系分泌物处理下有机碳、含水量、全氮、碱解氮、速效磷含量显著高于 CK（P＜0.05），其大小表现为HC＞MC＞LC＞CK ；而土壤全磷无明显差异（P＞0.05），与前人的研究结果一致（徐炜杰等，2017；王璐等，2019）。主要是由于根系分泌物中酸类物质水解增加土壤H＋浓度，使土壤pH降低。

土壤微生物量碳与代谢熵等虽是反映土壤质量的重要微生物学指标，但却不能反映微生物群落结构组成，在评价土壤质量方面有一定的局限性。土壤微生物种群组成决定了土壤养分周转及退化土壤质量的恢复进程，因此，对进入土壤的根系分泌物引起的土壤微生物群落组成与功能变化的评价十分重要（Chang，2019）。Biolog方法是基于微生物群落对碳源的利用度来描述微生物功能的动态变化，该方法具有灵敏度高，无需分离纯培养微生物，简便、快速等特点，被研究人员广泛应用于土壤微生物群落多样性的研究（Du et al.，2020）。本试验中共检测了 3种微生物的数量变化，结果显示，不同浓度植物根系分泌物处理下细菌、真菌、放线菌和微生物总数均显著高于对照（P＜0.05），不同处理之间差异均显著（P＜0.05），其大小表现为HC＞MC＞LC＞CK，与前人的研究结果吻合。他们的结果证实了植物根系分泌物中的葡萄糖、有机酸和酚酸等小分子化合物可以增加细菌和真菌的丰富度，同时可以促进土壤中细菌及真菌数量的生长。植物对土壤环境的重要影响之一是改变土壤微生物群落特征。研究证实不同的作物对土壤微生物群落的影响不同，作物通过根系分泌物在塑造土壤微生物群落中起着重要的作用，不同作物根系分泌物的成分和含量不同，其为根际微生物提供大量的营养和能量物质，使土壤微生物的活性和生态分布发生改变，并改变了土壤微生物群落的生长代谢，从而产生明显的根际效应（Wang et al.，2018）。

4 结论与展望

研究了不同浓度植物根系分泌物的微生态效应（土壤理化性质、土壤微生物群落功能多样性、微生物量碳、微生物熵、基础呼吸和代谢熵）。不同浓度根系分泌物处理 pH值显著低于 CK（P＜0.05）；有机碳、含水量、全氮、碱解氮、速效磷含量显著高于 CK（P＜0.05）。细菌、真菌、放线菌、微生物总数、微生物量碳、微生物熵和基础呼吸均显著高于对照（P＜0.05）。综合分析表明：中浓度根系分泌物处理的土壤与CK土壤微生物群落代谢特征相近，其明显不同于高浓度根系分泌物处理的土壤，说明它们对单一碳源的利用能力不同，其群落代谢特征存在差异。然而，在实际的根系环境中，根系分泌物成分复杂，根系微环境组成和影响因素多种多样。本试验在相同的土壤条件下，仅浇灌不同提取时间的根系分泌物而使得植物根际土壤微生物数量和土壤理化性状产生差异，这说明根际土壤微环境与植物根系分泌物产生和释放的种类和浓度有密切关系。虽然根系分泌物中小分子化合物、有机酸、酚酸等物质的功能已有大量研究，但大多数物质在复杂多样的根际环境中的作用是否与其单独作用对土壤微生物和理化性状的影响是否具一致性，仍需进一步研究。