磷肥种类对李氏禾富集铜、铬的影响及其生理响应

2021-04-12刘昭君林华王义安覃辉KongCHHUON

生态环境学报 2021年2期

刘昭君，林华*，王义安，覃辉，Kong CHHUON

1. 桂林理工大学环境科学与工程学院，广西桂林 541004；2. 柬埔寨技术研究所水文与水资源工程学院，柬埔寨金边 12000

李氏禾（Leersia HexandraSwartz）是中国境内首次发现的湿生铬超富集植物（张学洪等，2006），其具有多年生、繁殖能力强、单位面积生物量大、生长迅速、适合生长在潮湿和水生环境中，且一年内可多次收割等特点。因此，李氏禾是实现植物修复技术的一种理想植物。磷是组成植物体内细胞原生质的元素之一，对植物细胞的生长和增殖有重要作用；且是植物光合作用所需的重要元素，参与能量转移过程（张存款，2018）。磷浓度影响着光合作用，过高或过低的磷浓度都不利于光合作用的正常进行（杨晴等，2006）。缺磷会导致叶绿素含量降低，最终导致光合速率降低（Jacob et al.，1991；张永丽等，2004）。过量磷会减少植物对铜的吸收或形成Ca-P难溶盐导致植物缺钙（陈屏昭等，2004；郭延平等，2002）。

李氏禾作为铬的超富集植物对铜同样有超富集效果（满向甜等，2019）。施加适量的磷对提高生物量和重金属含量有促进作用（Huang et al.，2018；姚诗源，2019），但不同种类的磷肥的化学性质和作用效果也有所不同，陈青云等（2013）证明不同磷肥种类对蔬菜中重金属累积有一定的影响，刘昭兵等（2012）证明钙镁磷和过磷酸钙降低水稻茎叶和糙米中镉含量的效果最好，由此看出磷肥种类对植物对重金属的累积存在某种作用，但哪种磷肥可最大限度地提高植物累积重金属的量还需实验确定。本研究通过比较几种常见的磷肥对李氏禾生长、重金属累积以及蛋白质、丙二醛、叶绿素、抗氧化酶等生理响应的影响，来确定效果最佳的磷肥类型，探讨可能磷肥种类对李氏禾对铜、铬累积的影响。

1 实验部分

1.1 实验设计

实验所用的李氏禾采自广西省桂林市雁山镇的农户鱼塘边，未受重金属污染。采回后选取生长一致的李氏禾用清水清洗净根部至无淤泥后，然后置于15 cm直径的圆形塑料瓶中，加入25%全Hoagland营养液，置于人工气候箱中（光照周期14 h、白天25 ℃晚上20 ℃，相对湿度70%—75%，光照强度7000 Lx）。7 d后进行铜、铬处理。配制去磷霍格兰营养液（具体配方见表1）。分别加入4种不同的磷肥：磷酸氢二铵（DAP）、磷酸二氢铵（MAP）、磷酸氢钙（DCP）、过磷酸钙（SSP），每种磷肥分别设置 4组处理：A组（无磷，0P，0 mg·L-1），B 组（低磷，1/2P，11.38 mg·L-1）、C组（中磷，1P，22.76 mg·L-1），D组（高磷，2P，45.52 mg·L-1），设置两组对照组（CK1为无磷无铜铬培养，CK2为无铜铬培养），每组处理均采用重铬酸钾及五水硫酸铜进行配制成10 mg·L-1Cr(Ⅵ)和10 mg·L-1Cu(Ⅱ)的水溶液进行进行复合处理。每个实验处理重复3次，每个重复20—25株植物。处理15 d后收获李氏禾并进行重金属含量、叶绿素含量、蛋白含量、抗氧化酶活性的测定。在培养期间，每3天添加一次去磷Hoagland营养液以保持营养物质浓度和种类。收获时，先用自来水冲洗干净，再用20 mmol·L-1EDTA-2Na浸泡并用超声波震荡去除表面附着的重金属，最后用去离子水清洗。

表1 去磷霍格兰营养液配方Table 1 The formula of modified Hoagland’s nutrient solution without P

1.2 测定项目与方法

1.2.1 株高、生物量

利用直尺随机测量（周品成等，2019）李氏禾株高。每盆随机选10株李氏禾置于烘箱，65 ℃烘干48 h至恒质量（陈方圆等，2020），得到植物干质量，即生物量。

1.2.2 元素含量

收获时，取培养液并用0.45 μm滤膜过滤，用电感耦合等离子光谱仪（ICP）测定铜和铬的浓度。将李氏禾根部用去离子水清洗干净后置于烘箱，温度调整为105 ℃，时间为30 min，这一步是为了保持植物叶片中化学成分不发生转变和消耗，通过杀青及时终止植物体内氧化酶的活性，而后温度调整为75 ℃烘干至恒重，粉碎。利用HNO3-H2O2湿法消解，用ICP测定李氏禾植株根、茎和叶部的Cu含量。

1.2.3 生理指标

叶绿素含量测定采用乙醇匀浆，分光光度法测定，取0.1 g植物叶片鲜样，在黑暗中加10 mL无水乙醇进行匀浆，10000 g离心10 min，在470、649、665 nm测量上清液的吸光度。根据Dijk et al.（1988）的描述计算叶绿素浓度；

丙二醛（MDA）含量采用Heath et al.（1968）描述的方法，用5%三氯乙酸匀浆，0.67%硫代巴比妥酸（TBA）提取，在波长532、600 nm处测定吸光度；

可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝染色法（张志良，2009），595 nm波长下测定；

POD活性采用愈创木酚法（张志良，2009），在波长 470 nm测定；CAT活性采用紫外吸收法（Song et al.，2007），在波长240 nm下测定；SOD活性测定采用氮蓝四唑（NBT）光化还原法（张志良，2009），在560 nm波长下测定。每个指标测定进行3个重复。

1.3 统计分析

所有数据采用Microsoft Excel 2019处理，统计分析采用软件SPSS 24.0 LSD法进行差异显著分析。

2 结果与分析

2.1 不同种类磷肥对李氏禾生长的影响

株高和生物量是反映植物生长状态和对重金属耐性强弱的重要指标。与 0P处理组相比，各磷肥处理组对李氏禾生物量和株高（表2）均有显著作用。低、中、高磷酸盐浓度处理组均以 DAP处理组生物量和株高最大，分别达到了6.491、7.406、9.260 g和53.667、56.533、59.067 cm。与0P处理组相比，施用磷肥的李氏禾株高均存在显著性差异（P＜0.05），且各组间的差异性均达到显著水平（P＜0.05）。各磷肥处理组的生物量相对于对照显著（P＜0.05），且各组间的差异性均达到显著水平。其中 DAP、MAP、DCP处理组间生物量达到极其显著水平（P＜0.01）。

表2 不同磷肥处理李氏禾的生物量和株高Table 2 Biomass andplant height of L. hexandra with different phosphate treatment

2.2 不同种类磷肥处理对李氏禾富集铬的影响

由表3可知，施用SSP的处理组的李氏禾对重金属铬的富集最高。并在磷质量浓度为 22.76 mg·L-1时达到最大，根、茎、叶中铬质量分数分别为 828.08、202.00、64.00 mg·kg-1，SSP 组李氏禾地下和地上部分铬富集量均高于对照和其他磷肥组，且差异性显著（P＜0.05）。

表3 不同磷肥处理李氏禾根、茎、叶中的Cr含量Table 3 Cr concentration in root, stem and leaf of L. hexandra with different phosphate treatment

2.3 不同种类磷肥处理对李氏禾富集铜的影响

由表4可知，施用SSP的处理组的李氏禾对重金属铜的富集最高。并在中磷时达到最大，根、茎、叶中铜质量分数分别为 674.125、89.250、57.750 mg·kg-1，SSP组李氏禾地下和地上部分铜富集量均高于对照和其他磷肥组，且差异性显著（P＜0.05）。

表4 不同磷肥处理李氏禾根、茎、叶中的Cu含量Table 4 Cu concentration in root, stem and leaf of L. hexandra with different phosphate treatment

2.4 不同种类磷肥处理对李氏禾富集铜、铬的生理响应

如表5所示，施用DAP组的李氏禾叶绿素含量在所有处理组中最高。这是由于氮元素是叶绿素的重要组成元素，可能是由于MAP中氮元素含量最高，这更加有利于李氏禾进行光合作用和叶绿素的合成。在低、中、高磷酸盐水平下，相比于 0P处理组，DAP组李氏禾叶绿素含量分别增加了49.48%、70.81%和136.08%；与DCP组和SSP组相比分别提高了 28.68%、35.19%、71.51%和22.02%、27.55%、61.52%，并与其他各组存在显著性差异（P＜0.05）。DCP和SSP中无氮元素，所以相应的叶绿素含量均小于其余含氮元素的两个处理组。

表5 不同磷肥处理李氏禾叶中的叶绿素含量Table 5 The content of chlorophyll in L. Hexandra leaves with different phosphate treatment

如表6所示，各磷浓度处理组可溶性蛋白质含量均与0P处理组存在极显著差异（P＜0.01），DAP组李氏禾蛋白质含量在所有处理组中最高，这与叶绿素研究结果相同。在低、中、高浓度磷酸盐处理水平下，DAP组李氏禾蛋白质含量达到最大，相比于 0P处理组，分别提高了 38.10%、50.00%和84.52%；而SSP处理组李氏禾可溶性蛋白的促进作用最小，相对于 0P处理组，分别提高了 7.23%、20.48%和28.92%。MAP和DCP处理组效果处于以上两者之间，且随着磷酸盐浓度的增加，均出现上升趋势。

表6 不同磷肥处理李氏禾叶中的蛋白质含量Table 6 The content of protein in L. Hexandra leaves with different phosphate treatment

由表7、8可知，各处理组丙二醛含量均低于0P处理组，其中NH4HPO4处理组在中磷时出现最小值，且与其他处理组间存在显著性差异（P＜0.05），此时李氏禾细胞受到的损伤最小；在低、中、高磷酸盐处理水平下，NH4HPO4处理组李氏禾丙二醛含量分别降低了14.10%、19.40%和3.35%，有效的缓解了铜、铬对李氏禾的伤害。各磷浓度处理组SOD酶活性均与 0P处理组存在显著差异（P＜0.05），随着磷浓度增加，低、中、高磷酸盐处理组 SOD活性先升高后下降，相较于 0P处理组，各种磷肥处理组的李氏禾叶片中的 SOD活性均有提高，其中SSP处理组促进效果最好，分别增加了62.41%、72.07%和24.10%。随着磷浓度的提升，李氏禾叶片中的 POD酶活性呈现出上升的趋势，在磷质量浓度为22.76 mg·L-1时叶片中POD酶活性达到最大，此后呈明显下降趋势，在45.52 mg·L-1时POD酶活性减小。与0P处理组相比，SSP处理组的促进效果最好，当磷质量浓度为22.76 mg·L-1时均达到最大，分别增加了 37.81%、73.76%、38.82%。所有处理组中 CAT酶的活性都随磷浓度增加出现先增后降的趋势，且SSP处理组均达到最大，与0P处理组相比，SSP处理组李氏禾CAT酶活性分别增加了25.64%、43.23%和21.75%。

表7 不同磷肥处理李氏禾叶中的丙二醛含量和SOD活性Table 7 The content of MDA and the activity of SOD in L. Hexandra leaves with different phosphate treatment

表8 不同磷肥处理李氏禾叶中的POD、CAT活性Table 8 The activity of POD and CAT in L. Hexandra leaves with different phosphate treatment

3 讨论

磷是植物的组成成分之一，也是植物生长过程中的必需元素，在植物代谢、酶活性调节、光合作用等方面都扮演着重要的角色。磷在植物光合作用、呼吸作用和生理生化调节过程中起着重要作用（Rao et al.，1990；贺军军等，2016）。在本实验中，与 0P处理组相比较可知，磷肥处理组李氏禾的株高均存在显著性差异，DAP处理组的李氏禾株高和生物量最大。随着营养液中磷浓度的增大，李氏禾株高和生物量都呈上升趋势，说明施加磷肥明显促进植物生长。这一结果与Huang et al（.2013）、Singh et al.（2015）和 Dai et al.（2017）的研究一致。DAP和MAP含有利于光合作用的元素氮和磷，相对其他2种磷肥而言更有利于植物进行光合作用，这可能是导致DAP和MAP处理组株高和生物量大于其他两组的原因（Zhang et al.，2017）。此外，施加磷肥降低了重金属对植物的胁迫，并有助于叶绿素的形成从而叶绿素增加（Bustingorri et al.，2017；杨晴等，2006）。

植物体内可溶性蛋白大部分是参与植物生理代谢的酶类，可溶性蛋白是重要的生理生化指标，其含量可以反映出植物体总代谢程度（王英，2018），也可以衡量植物在某种条件下是否会发生重金属胁迫。Hartley et al.（2001）证明砷诱导的氧化应激在植物中引起许多毒性效应，使可溶性蛋白质含量降低。而Kamran et al.（2018）证明加入磷酸盐可以有效减轻砷的毒性。在本研究中，可溶性蛋白含量随供磷水平的提高而增加，在磷供给浓度最大时值最高，这与孙海龙（2005）得出的结论相同。DAP和MAP处理组的可溶性蛋白含量均高于其他0P处理组，这可能是因为磷会促进植物对氮元素的吸收，有利于蛋白质的合成，从而提高了叶片可溶性蛋白的含量，可能是适宜磷能促进植物体内铵态氮和硝态氮的同化；磷又可以加强植物的呼吸作用，呼吸作用会形成多种有机酸，从而转化为氨基酸，使蛋白质含量升高，在进一步合成蛋白质中，ATP又是能量的供应者（马佩玲，2018）。

作为农业生产中增加产量的一种重要方式，施肥也可用于加强植物修复（廖晓勇等，2007）。Barrutia et al.（2009）报道了施肥极大地刺激了植物的生长并提高了植物富集的效率。Zhou et al.（2020）证明施加磷肥可以有效提高植物对铜的吸收。在本研究中也出现了类似的现象，施加适量的磷肥能有效地增加李氏禾对铜、铬的富集量，添加过磷酸钙的实验组铜、铬的富集量明显高于其他处理组，可能是过磷酸钙水溶液为弱酸性，而重金属铜、铬可能在碱性条件下发生了共沉淀作用，导致营养液中有效铜、铬含量降低，并且pH还可能影响了Ca离子通道转运铜、铬。王宝奇（2007）的研究证明随着土壤pH的升高，重金属铜锌共沉淀作用，大多以沉淀态的形式存在于土壤中，有效性显著下降。田静等（2014）证明单一元素铜和铬处理的李氏禾对铜、铬的吸收与钙离子通道有关。李氏禾重金属富集地上部分大于地下部分，相关研究也有类似情况（Zhang et al.，2007；陈俊等，2008）。

当植物处在逆境条件下，会直接或间接形成过量ROS，而ROS对细胞内的膜系统、脂类、蛋白质和核酸等大分子存在破坏作用（郑荣梁，2007）。丙二醛（MDA）含量越高，说明植物细胞膜质过氧化程度越高，细胞膜受到的伤害越严重（李兆君等，2004；王晓维等，2014）。本实验中，与对照组X相比，在铜、铬胁迫下MDA含量降低，说明重金属毒性降低。Dai et al.（2017）证明，施加磷肥能降低镉胁迫下李氏禾叶片中丙二醛的含量，这与本实验结果类似。施加磷肥后，抗氧化系统被激发以消除ROS，这与丙二醛含量降低有关（Zhou et al.，2020）。超氧化歧物酶（SOD）、过氧化物酶（POD）等可清除有害的体内活性氧保护植物细胞免受活性氧的损伤（顾艾博，2014；唐茜等，2009），从而保护植物的膜系统。在植物受到重金属胁迫时，POD和CAT酶活性会改变，从而间接反映植物受伤害的程度（潘芳慧等，2018）。本实验中，在低浓度磷胁迫下，各处理组 SOD活性均有所升高，增加其抗性以适应逆境生长环境。SOD和POD酶在低、中、高浓度磷处理时呈现先增后降的趋势，说明SOD和POD酶在低浓度磷处理时对李氏禾有一定的保护作用，在高浓度磷处理时，活性氧和抗氧化系统平衡被破坏，从而被抑制。