三氯甲烷-水振荡萃取法建立药用辅料氢化大豆卵磷脂细菌内毒素检查方法

刘雪莉 袁坤 赵冬 王铁战 崔晓燕 甄晓兰 施麟 李挥

磷脂是生命的基础物质，也是制备脂质体的主要膜材，在生物体内可降解，且无毒性、无免疫原性[1]。磷脂氢化后的氢化大豆卵磷脂(HSPC)增强了其亲水性和稳定性[2]，从而可增强脂质体制剂的稳定性，因此在长效靶向制剂盐酸多柔比星脂质体注射液[3,4]、两性霉素B脂质体注射液[5,6]等药物制剂[7,8]中更多应用。作为装载药物的辅料，其使用量较大，故控制药用辅料氢化大豆卵磷脂中的细菌内毒素含量，对于药物制剂安全性具有重要作用。细菌内毒素检查所用鲎试剂，与内毒素的反应一般在水溶液中进行，但HSPC不溶于水，细菌内毒素检查无法正常进行。查阅用有机溶剂溶解样品，再进行内毒素检查的相关研究报道[9-14]后，我们采用三氯甲烷溶解HSPC，再加入BET水振荡萃取，进行HSPC细菌内毒素检查法的研究。经过探索与验证，通过干扰扩大及内毒素回收等实验，证明该法符合《中国药典》2020年版通则1143[15]与现行美国药典USP42-<85> 的要求，可用于控制药用辅料氢化大豆卵磷脂中细菌内毒素含量，其检查限值可定为：每1毫克氢化大豆卵磷脂中含内毒素的量应<0.006 EU。

1 材料与方法

1.1 实验材料 氢化大豆卵磷脂(批号525600-2160616-01、525600-2160654-01、525600-2160658-01)。鲎试剂1(TAL1，批号1805163，规格为每支0.1 ml，λ=0.06 EU/ml，湛江安度斯生物有限公司)；鲎试剂2(TAL2，批号1904100，规格为每支0.1 ml，λ=0.06 EU/ml，湛江博康海洋生物有限公司)。细菌内毒素工作标准品(CSE，批号150601-201784，规格为每支80 EU，中国食品药品检定研究院)。细菌内毒素检查用水(BET水，批号1706070，规格50 ml，湛江安度斯生物有限公司)。三氯甲烷(分析纯，批号20190103，天津市科密欧化学试剂有限公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 TAL灵敏度复核试验：按2020年版《中国药典》通则1143细菌内毒素检查法[15]进行试验，其灵敏度在0.5～2.0 λ范围内，方可用于后续实验。

1.2.2 供试品有效稀释浓度计算：HSPC在脂质体中作为装载药物辅料使用，根据临床脂质体最大使用量以及HSPC在处方中的含量，计算得到HSPC细菌内毒素检查限值L=0.006 EU/mg，则最低有效浓度为MVC=λ/L=0.06EU/ml/0.006 EU/mg=10 mg/ml。

1.2.3 供试品干扰预试验：分别量取5 ml三氯甲烷和5 ml BET水，混合均匀，涡旋振荡2 min，静置30 s以上使之分层，获得三氯甲烷饱和水溶液(上层溶液)和水饱和三氯甲烷溶液(下层溶液)备用。见图1。

图1 三氯甲烷-水振荡萃取法对氢化大豆卵磷脂的处理过程

精密称取3批HSPC(编号①、②、③)200.0 mg，分别加入1 ml水饱和三氯甲烷溶液，涡旋振荡使之充分溶解，然后再加入三氯甲烷饱和水溶液4ml，充分涡旋振荡，静置分层，使上层成为澄清均一的溶液(相当于50 mg/ml的供试品溶液)，取上层溶液1.0 ml加BET水1.0 ml制备成25 mg/ml的溶液(如图1所示)，将此浓度溶液同时分两种方式进行稀释：(1)取此溶液1.0 ml加BET水1.0 ml，稀释后的溶液(12.5 mg/ml)记为供试品溶液(NPC:即为最小有效稀释浓度的1.25倍)；(2)取溶液1.0 ml加入4 λ浓度的细菌内毒素标准溶液1.0 ml，使浓度为12.5 mg/ml的供试品中均有2λ浓度的细菌内毒素，此溶液为供试品阳性对照溶液(PPC)。分别取鲎试剂TAL A、TAL B(灵敏度均为0.06 EU/ml)，与上述NPC和PPC进行反应，阴性(NC：只加入BET水)、阳性(PC：加入2 λ浓度的细菌内毒素工作品)对照各两管，于(37±1)℃保温(60±2)min。

1.2.4 细菌内毒素回收率验证试验：上述三氯甲烷溶解，水振荡萃取操作，是否会造成样品本身所含细菌内毒素的流失，造成假阴性现象导致误判。基于此问题，我们建立细菌内毒素回收实验。见图2。

图2 细菌内毒素工作标准品回收验证试验处理方法

将细菌内毒素工作标准品(CSE)，用BET水溶解成100 EU/ml的母液备用。取母液20 μl加至1.04 ml的水饱和三氯甲烷液中混匀，再加入三氯甲烷饱和BET水溶液4.16 ml，振荡萃取，水溶液中内毒素含量相当于0.48 EU/ml(以上操作与萃取时水与三氯甲烷的比例，与预实验中对HSPC的处理完全一致)。再用BET水稀释，配制2.0 λ、1.0 λ、0.5 λ、0.25 λ浓度(0.12 EU/ml、0.06 EU/ml、0.03 EU/ml、0.015 EU/ml)的CSE溶液，进行细菌内毒素回收验证。

1.2.5 供试品干扰确证试验：干扰确证试验根据预实验结果而设定，操作方法严格执行2020年版《中国药典》通则1143及 USP42-<85>细菌内毒素检查法。

2 结果

2.1 TAL灵敏度复核 按2020年版《中国药典》通则1143[15]进行TAL灵敏度复核试验，结果其灵敏度均在0.5～2.0 λ范围内，符合规定，可用于细菌内毒素干扰试验及样品检测实验(“+”表示鲎试剂安瓿从恒温箱中轻轻取出，缓缓倒转180°，所形成凝胶不变形，不滑脱。“-” 表示未形成凝胶或凝胶不坚实，变形并滑脱)。见表1。

表1 TAL灵敏度复核试验结果

2.2 供试品干扰预试验 按图1所示进行供试品干扰预试验操作，实验结果：当浓度为最小有效稀释浓度(MVC=10 mg/ml)的1.25倍，即12.5 mg/ml时对TAL A、TAL B均无干扰作用，故可将HSPC 12.5 mg/ml浓度进行正式干扰试验。见表2。

表2 氢化大豆卵磷脂干扰预试验结果

2.3 细菌内毒素回收率验证试验 细菌内毒素回收率验证试验结果表明：TAL A、TAL B的Et在0.5～2 λ范围内，即0.03～0.12 EU/ml范围内，说明三氯甲烷溶解以及水振荡萃取的操作方法对内毒素含量无影响。见表3。

表3 细菌内毒素回收验证结果

2.4 供试品干扰确证试验 根据干扰预试验结果，将3批供试品，采用1.25倍MVC浓度(12.5 mg/ml)进行干扰确证试验，结果表明：3批供试品在12.5 mg/ml浓度时，Et均在0.5～2 λ间，对鲎试剂无干扰作用。见表4。

表4 氢化大豆卵磷脂干扰确证试验结果

2.5 三批供试品检查 三批HSPC(供试品编号①至③)，按2020年版《中国药典》通则1143，以及 USP42-<85>细菌内毒素检查法，以检查限值为0.006 EU/mg进行细菌内毒素检查，结果均为阴性，符合规定。见表5。

表5 样品细菌内毒素检查结果

3 讨论

3.1 三氯甲烷-水振荡萃取法可用于氢化大豆卵磷脂细菌内毒素检查 根据以上试验研究，通过特定比例的三氯甲烷-水振荡萃取法，可建立符合《中国药典》2020年版通则1143以及 USP42-<85>的药用辅料氢化大豆卵磷脂细菌内毒素检查法，检查限值定为每1毫克氢化大豆卵磷脂中含内毒素的量应<0.006 EU，此方法可控制药用辅料氢化大豆卵磷脂中的细菌内毒素含量。

3.2 三氯甲烷和水互饱和溶液的制备与使用关键 氢化大豆卵磷脂在第一步溶解与萃取时需要采用水饱和三氯甲烷溶液，及三氯甲烷饱和水溶液，其余步骤均用BET水稀释。饱和溶液制备时，BET水和三氯甲烷需充分混合，确保形成各自的饱和溶液，使萃取过程不会发生氢化大豆卵磷脂的析出而致溶液浑浊，从而保证研究方法的可行性。

用水饱和三氯甲烷溶液溶解HSPC时，先溶解为200 mg/ml的溶液，然后用三氯甲烷饱和水溶液萃取其中含有的细菌内内毒素，三氯甲烷水溶液和水饱和三氯甲烷溶液的体积比≥4∶1，方可使内毒素萃取完全；小于此体积比，无法通过细菌内毒素回收率验证试验，易导致实验结果假阴性，从而造成误判，无法控制药用辅料氢化大豆卵磷脂的质量安全。

3.3 药用辅料氢化大豆卵磷脂细菌内毒素检查标准制定 沿用中国药典的表述习惯，药用辅料氢化大豆卵磷脂细菌内毒素检查法可定为：取本品，可用0.06 EU/ml及以上灵敏度鲎试剂，依法检查(《中国药典》2020年版通则1143)，每1毫克氢化大豆卵磷脂中含内毒素的量应<0.006 EU。此方法同样符合美国药典USP42-<85>细菌内毒素检查法的要求。

三氯甲烷-水振荡萃取法建立的药用辅料氢化大豆卵磷脂细菌内毒素检查方法，为其安全性检查标准的制定提供了有力的研究资料；为其他常规细菌内毒素检查法不能满足的药品原料及药用辅料方法学[16]，扩展了思路。

3.4 细菌内毒素检查法为检测化学药品及辅料中热原物质的主要技术 热原物质检测技术是保证药品安全性的关键技术，目前中国药典收录的主要检测方法为家兔热原检查法及细菌内毒素检查法，并规定：对于化学药品注射液，首选细菌内毒素检查项[17]。细菌内毒素检查法包括凝胶法和光度法共6种检查方法[18]，当结果有争议时，以凝胶限度试验结果为准[15]。故在此研究中，我们采用具有仲裁意义的凝胶限度试验建立药用辅料氢化大豆卵磷脂细菌内毒素检查方法，以更好地控制辅料质量，为确保药物制剂质量安全做好充分的技术支持。

3.5 重组C因子法的后续研究 C因子是鲎试剂中对细菌内毒素敏感的蛋白，能够选择性识别内毒素并激活蛋白酶级联反应[19]。重组C因子法作为细菌内毒素检查法的补充方法，已首次被2020年版中国药典收录[18]，近年来受到广泛关注与研究[20-22]。通过生物技术重组获得的鲎试剂中的C因子，可代替海洋生物鲎作为鲎试剂原料唯一来源，具有很好的发展前景。本科研团队将继续进行重组C因子法对药用辅料氢化大豆卵磷脂中细菌内毒素的探索研究，以期采用新技术、多手段、高质量控制药品安全。