miR-514b-3p靶向MDM2对肺癌细胞增殖、迁移、侵袭的影响

李小龙 陈海生 吉飞跃

肺癌是全球恶性肿瘤相关死亡的主要原因。肺癌包括非小细胞肺癌和小细胞肺癌两种类型，其中非小细胞肺癌占所有肺癌病例的80%～85%，其5年生存率较低，即使对早期患者进行有针对性的手术，术后复发率也高于其他类型的癌症[1]。肿瘤转移是导致非小细胞肺癌死亡的主要原因，但转移扩散的分子机制尚不清楚。最近的证据表明，miRNA在肿瘤转移中起着重要的作用[2,3]。miR-514b-3p定位于X染色体，研究发现miR-514b-3p在直肠癌中明显下调表达，miR-514b-3p通过增加上皮标志物和减少间充质标志物的表达来减少结直肠癌细胞的迁移、侵袭和耐药性[4]。但miR-514b-3p在肺癌中的表达情况笔者还未见报道，miR-514b-3p在肺癌中的功能和作用机制也不明确。本研究分析miR-514b-3p表达与肺癌细胞增殖、迁移、侵袭的关系，探讨其作用机制，以期为肺癌临床生物靶点的开发奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料 收集2017年11月至2018年10月于我院确诊并进行手术切除的52例肺癌组织及其相应的癌旁组织标本，年龄30～75岁，平均年龄(50±7)岁。按照肿瘤-淋巴结-转移分期，Ⅰ期15例，Ⅱ期17例，Ⅲ期20例。患者术前均未接受放疗、化疗。开展本研究前患者均签订知情同意书，并获得医院伦理委员会批准。

1.2 仪器与试剂 肺腺癌细胞系A549购于美国ATCC；DMEM培养液、青链霉素混合液、胎牛血清均为美国Gibco公司产品；转染试剂Lipfectmine 2000为Invitrogen公司产品；兔源Ⅰ抗CyclinD1、P21、MMP-2、GAPDH购于美国Abcam公司；鼠源Ⅰ抗E-cadherin购于美国Santa Cruz公司；羊抗兔以羊抗鼠Ⅱ抗为武汉博士德公司产品；miRNA反转录和定量PCR试剂盒购自上海天根生化公司；miR-514b-3p mimics、miR-NC、si-MDM2、si-NC、anti-miR-NC、anti-miR-514b-3p、pcDNA3.1和pcDNA3.1-MDM2、以及WT-MDM2和MUT-MDM2的构建测序均由上海吉玛制药有限公司提供；四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)试剂盒购于北京索莱宝公司；Transwell小室和基质胶购自美国corning公司。

1.3 细胞培养、转染与分组 采用DMEM培养液(含10%胎牛血清含量和1%青链霉素溶液)培养A549细胞，后将其置于37℃、体积为5%的CO2培养箱中。将miR-514b-3p mimics、miR-NC、si-MDM2、si-NC分别与LipofectamineTM 2000混匀，室温静置20 min后，缓慢滴入培养液中，共培养4 h后，更换新鲜正常培养液继续培养24～72 h，再用于后续研究。根据转染物不同依次标记为miR-514b-3p组、miR-NC组、si-MDM2组和si-NC组。为进一步证实miR-514b-3p是通过调控MDM2表达进而影响A549细胞的生物学行为，将miR-514b-3p mimics与pcDNA3.1或pcDNA3.1-MDM2同时转染至A549细胞，几次标记为miR-514b-3p+pcDNA3.1组、miR-514b-3p+pcDNA3.1-MDM2组，检测细胞的生物学行为变化。

1.4 qRT-PCR检测 用TRIzol分别提取肺癌组织、癌旁组织以及经转染的A549细胞的总RNA，分别测定其浓度和纯度，采用miRNA逆转录试剂盒将miR-514b-3p逆转录为cDNA，随后采用miRNA定量PCR试剂盒进行定量分析。

1.5 双荧光素酶报告基因检测 利用生物信息软件预测miR-514b-3p的靶基因。发现MDM2为候选靶基因之一。构建野生型WT-MDM2和突变型MUT-MDM2的RAP2B-3’UTR荧光素酶报告基因载体，严格按照LipofectamineTM 2000使用说明将miR-514b-3p mimics和miR-NC分别与WT-MDM2和MUT-MDM2共转染A549细胞，将各组细胞置于CO2培养箱培养48 h后，进行荧光素酶活性测定。

1.6 MTT法检测细胞活力 将A549细胞按照2×103个/孔接种于96孔板，按照1.3分组进行转染后，分别于转染后24 h、48 h、72 h时利用MTT细胞活力检测试剂盒检测细胞增殖活力，采用酶标仪测定490 nm 波长处各孔的吸光度值。

1.7 Transwell法检测细胞迁移和侵袭能力/1.6流式细胞术检测细胞凋亡 迁移实验：转染48 h的细胞用0.25%胰酶消化，用无血清DMEM培养基制成单细胞悬液。稀释后，取300 μl细胞数1×105个细胞悬液加入到Transwell上室中，在Transwell下室加入500 μl含有10%胎牛血清的DMEM培养液，细胞继续培养24 h。用无菌棉签擦去上室膜未过膜细胞，PBS液冲洗2次，采用甲醇固定20 min，随后采用0.4%的结晶紫染液室温孵育2 h，显微镜下随机选取3个视野拍照，计数，进行统计分析。侵袭实验采用在Transwell上室上表面包被基质胶的Transwell小室，其他步骤同迁移实验。

1.8 Western blot检测 细胞转染48 h后，收集细胞，PBS液漂洗细胞，用RIPA裂解液裂解细胞，离心收集上清液，BCA试剂盒测定蛋白浓度。取适量经煮沸变性细胞蛋白，上样至SDS-PAGE加样孔进行电泳分离，之后将已分离的细胞蛋白转移至PVDF膜。转膜后室温条件采用5%脱脂牛奶封闭膜30 min，在室温条件下孵育Ⅰ抗2 h，Western blot洗膜液洗膜3次，每次10 min，在室温条件下孵育Ⅱ抗1 h，Western blot洗膜液洗膜3次，每次10 min。用ECL显影检测蛋白表达。

2 结果

2.1 miR-514b-3p在肺癌组织和癌旁组织中的表达 qRT-PCR检测肺癌组织和癌旁组织中miR-514b-3p的表达水平。与癌旁组织相比，肺癌组织中miR-514b-3p的表达水平显著降低(P<0.05)。见表1。

表1 miR-514b-3p在肺癌组织和癌旁组织中的表达

2.2 过表达miR-514b-3p对细胞A549增殖、迁移、侵袭的影响 与miR-NC组比较，miR-514b-3p组A549细胞miR-514b-3p的表达水平显著升高，表明过表达miR-514b-3p的A549细胞株构建成功。与miR-NC组比较，miR-514b-3p组A549细胞Cyclin D1和MMP-2蛋白的表达水平显著降低，P21和E-cadherin蛋白的表达水平显著升高，细胞增殖活力显著降低，迁移和侵袭细胞数目显著减少(P<0.05)。见图1，表2、3。

图1 过表达miR-514b-3p对细胞A549增殖、迁移、侵袭的影响;A Transwell实验检测A549细胞迁移、侵袭能力;B Western blot检测A549细胞中Cyclin D1、P21、MMP-2和E-cadherin蛋白表达

表2 过表达miR-514b-3p对细胞A549增殖的影响

表3 过表达miR-514b-3p对细胞A549迁移、侵袭的影

2.3 miR-514b-3p靶向、调控MDM2的表达 利用生物信息学软件TargetScan在线预测miR-514b-3p的靶基因，发现miR-514b-3p与MDM2的3’-UTR存在部分连续互补的碱基对。与miR-NC和WT-MDM2共转染组比较，miR-514b-3p mimics和WT-MDM2共转染组A549细胞的荧光素酶活性显著降低(P<0.05)；与miR-NC和MUT-MDM2共转染组比较，miR-514b-3p mimics和MUT-MDM2共转染组A549细胞的荧光素酶活性变化差异无统计学意义(P>0.05)。与miR-NC组比较，miR-514b-3p组A549细胞MDM2蛋白的表达水平显著降低；与anti-miR-NC组比较，anti-miR-514b-3p组A549细胞MDM2蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。提示MDM2是miR-514b-3p的靶基因，miR-514b-3p可负性调控MDM2表达。见图2，表4、5。

图2 miR-514b-3p靶向、调控MDM2;A MDM2的3’UTR含有miR-514b-3p的互补序列;B miR-514b-3p调控MDM2的表达

表4 双荧光素酶报告实验

表5 miR-514b-3p调控MDM2的表达

2.4 抑制MDM2表达对细胞A549增殖、迁移、侵袭的影响 与si-NC组比较，si-MDM2组A549细胞MDM2的表达水平显著降低P<0.05)，表明抑制MDM2表达的A549细胞株构建成功。与si-NC组比较，si-MDM2组A549细胞Cyclin D1和MMP-2蛋白的表达水平显著降低，P21和E-cadherin蛋白的表达水平显著升高，细胞增殖活力显著降低，迁移和侵袭细胞数目显著减少(P<0.05)。见图3，表6、7。

图3 抑制MDM2表达对细胞A549增殖、迁移、侵袭蛋白表达的影响

表6 抑制MDM2表达对细胞A549增殖的影响

表7 抑制MDM2表达对细胞A549迁移、侵袭的影

2.5 过表达MDM2逆转miR-514b-3p对细胞A549增殖、迁移、侵袭的抑制作用 与miR-NC组比较，miR-514b-3p组A549细胞MDM2、Cyclin D1和MMP-2蛋白的表达水平显著降低，P21和E-cadherin蛋白的表达水平显著升高，细胞增殖活力显著降低，迁移和侵袭细胞数目显著减少(P<0.05)；与miR-514b-3p+pcDNA3.1组比较，miR-514b-3p+pcDNA3.1-MDM2组A549细胞MDM2、Cyclin D1和MMP-2蛋白的表达水平显著升高，P21和E-cadherin蛋白的表达水平显著降低，细胞增殖活力显著增强，迁移和侵袭细胞数目显著增加(P<0.05)。见图4，表8、9。

表8 过表达MDM2能逆转miR-514b-3p对细胞A549增殖的影响

图4 过表达MDM2能逆转miR-514b-3p对细胞A549增殖、迁移、侵袭蛋白表达的影响

3 讨论

近年来，全球肺癌发病率呈逐步上升趋势。据统计，大约90%的肺癌死亡与肿瘤的转移扩散有关。尽管目前临床肺癌诊疗技术不断提高，但并未取得显著的治疗效果。因此，如何有效的控制肺癌细胞转移扩散是改善肺癌患者预后的关键。

miRNA是一种长度约为22个核苷酸的非编码微小RNA，其通过与靶mRNA特定位点结合发挥转录后调控作用，导致转录本降解或翻译抑制，参与对细胞的增殖、分化、凋亡等多种重要细胞活动的调控[5]。近年来，越来越多的研究表明，miRNA在控制癌细胞的侵袭和转移方面发挥着重要的作用。Liu等[6]研究发现，非小细胞肺癌组织中miR-25表达上调，miR-25的上调与非小细胞肺癌患者的淋巴结转移和TNM分期有关，并增强了癌细胞的迁移和侵袭能力；miR-19可引起肺癌细胞上皮间质转化，并伴有生长抑制[7]；然而，miR-203通过下调RGS17抑制非小细胞肺癌的细胞增殖、侵袭和迁移[8]。miR-514隶属于miR-506～514簇，研究发现，在蕈样真菌病肿瘤期皮肤组织中miR-514b-3p表达上调[9]；然而，miR-514b-3p在结直肠癌中表达下调，过表达miR-514b-3p可抑制结肠癌细胞的迁移侵袭，而miR-514b-5p却发挥促转移作用[4]；miR-514a-3p在肾癌组织中表达下调，上调miR-514a-3p通过靶向EGFR抑制透明细胞肾细胞癌细胞增殖和上皮间质转化[10,11]；此外，在睾丸生殖细胞瘤中miR-514a-3p也呈低表达，上调miR-514a-3p可抑制PEG3表达进而抑制NF-kappa B通路活化，促进肿瘤细胞凋亡[12]。本研究发现，miR-514b-3p在肺癌组织中表达显著降低，过表达miR-514b-3p可显著抑制Cyclin D1和MMP-2表达，促进P21和E-cadherin表达，降低肺癌细胞的增殖和迁移侵袭能力，表明miR-514b-3p在肺癌中发挥抑癌作用，与miR-514b-3p在结直肠癌的抑癌作用[4]相一致。

表9 过表达MDM2能逆转miR-514b-3p对细胞A549迁移、侵袭的影响

为探索miR-514b-3p抑制肺癌细胞增殖和迁移侵袭的分子机制，利用生物信息学软件进行靶基因预测，发现miR-514b-3p与MDM2存在部分连续互补的核苷酸。鼠双微体基因2(murine double mimute 2，MDM2)是一种与多种类型的恶性肿瘤转移相关的癌基因[13]。MDM2主要作为E3连接酶作用于多种底物，通常为肿瘤抑制因子，如p53和Rb，促进其泛素化和蛋白酶体依赖降解，从而促进肿瘤恶性化。研究发现，MDM2在肺癌中表达上调，且MDM2的上调促进肿瘤的恶性增殖和转移，可作为预后判断指标[14,15]；MDM2还可通过激活Smad通路促进卵巢癌SKOV3细胞的上皮-间质转化和转移[16]；此外，miR-758-3p和miR-509-5p通过靶向下调MDM2表达分别抑制肝癌和前列腺癌细胞的迁移和侵袭[17,18]。本研究通过双荧光素酶报告基因实验和Western blot证实，miR-514b-3p可负性调控MDM2的表达。随后，构建抑制MDM2表达肺癌细胞株发现，抑制MDM2表达可抑制肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。进一步研究显示过表达MDM2可逆转miR-514b-3p对肺癌细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用。提示，过表达miR-514b-3p通过下调MDM2抑制肺癌细胞增殖、迁移和侵袭。

综上所述，miR-514b-3p在肺癌组织中表达下调，上调miR-514b-3p可通过抑制MDM2表达进而抑制肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力，为肺癌的临床靶向分子治疗提供了新的方向。