CDKN2A在宫颈癌组织中的表达及调控Wnt/β-catenin通路影响SiHa细胞增殖和凋亡的机制

江静 陈勇 蒋璐

宫颈癌是女性生殖系统中常见的恶性肿瘤，也是影响全球女性癌症死亡的主要原因之一[1]。目前宫颈癌的主要治疗方法包括手术(包括盆腔淋巴结切除术和根治性子宫切除术)、放疗和化疗。虽然这些治疗方法取得了一定的进展，但宫颈癌患者的生存率并未得到显著提高。放疗和化疗产生较大的不良反应，严重阻碍治疗效果，且在很大程度上影响患者的生活质量[2]。目前，包括分子靶向治疗和基因治疗等治疗方式替代辅助治疗，在肿瘤治疗中得到广泛应用[3,4]。宫颈癌的发生和发展与癌基因的激活、抑癌基因的失活等多基因调控密切相关[5]。因此，发掘与宫颈癌发生相关的基因，并探索其作用机制对宫颈癌的基因治疗和患者预后具有重要意义。细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白2A(cyclin-dependent kinase inhibitor 2A，CDKN2A)基因位于染色体9p21上，属于肿瘤抑制基因。有报道在几种类型的恶性肿瘤中CDKN2A基因启动子区域的高甲基化导致其失活，包括食管癌、乳腺癌和鳞状细胞肺癌等[6-8]。系统鉴定浸润性宫颈癌发展中的关键基因和途径中发现，CDKN2A等基因的调节异常可能与宫颈癌的进展相关[9]。但CDKN2A在宫颈癌组织的表达情况及对宫颈癌细胞增殖和凋亡的影响笔者尚未见报道。因此，本研究检测CDKN2A在宫颈癌组织的表达情况，并通过体外实验研究CDKN2A对宫颈癌SiHa细胞增殖和凋亡的影响，并进一步探究其可能的分子机制，以期为宫颈癌的基因治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 收集2018年6月至2019年6月在重庆市第七人民医院和陆军军医大学第一附属医院行手术切除的宫颈癌组织及相应癌旁组织(距肿瘤边缘>5 cm)标本，共30例，标本取下立即置于液氮中保存，患者年龄35～65岁。标本均经病理科鉴定，标本采集均经患者及家属知情同意并签署知情同意书，且经过医院的伦理学通过；患者术前均未接受放疗或化疗等其他辅助治疗。

1.2 细胞株与主要试剂 人宫颈癌SiHa细胞株(中国科学院上海细胞库)；胰蛋白酶、RPMI-1640培养基、胎牛血清(美国Gibco公司)；青霉素-链霉素双抗(北京雷根生物技术有限公司)；CDKN2A过表达载体质粒(pc-CDKN2A)及空载质粒(pcDNA)(广州锐博生物科技有限公司)；Lipofectamine 2000脂质体转染试剂(美国Invitrogen公司)；MTT试剂(美国Sigma公司)；AnnexinⅤ-FITC/PI双染色细凋亡检测试剂盒(日本TaKaRa公司)；RIPA裂解液(上海碧云天生物技术研究所)；BCA蛋白浓度检测试剂盒、ECL化学发光检测试剂盒(美国Piece公司)；PCNA、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9、β-catenin和c-myc单抗及二抗(美国CST公司)。

1.3 细胞培养 从液氮中取出保存的人宫颈癌SiHa细胞，溶解复苏后接种在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液(含100 mg/L青霉素-链霉素双抗)的培养瓶中，放置于5% CO2、饱和湿度、37℃恒温培养箱中培养，及时更换新的培养液，细胞贴壁后融合度>90%，以0.25%的胰蛋白酶消化细胞，根据需要进行传代培养，取对数期的SiHa细胞用于后续研究。

1.4 细胞转染与分组 生长状态良好的SiHa细胞以胰酶消化，以1×106个/孔接种到6孔板中，于37℃培养箱过夜培养，待细胞生长密度达60%时进行转染，转染具体操作参照Lipofectamine 2000脂质体转染试剂使用说明书，分别将CDKN2A过表达载体质粒或空载质粒转染至SiHa细胞，其中转染CDKN2A过表达载体质粒的SiHa细胞为pc-CDKN2A组，转染空载质粒的SiHa细胞为pcDNA组，同时将未行转染的SiHa细胞为Control组，3组SiHa细胞转染后于37℃培养箱继续培养，6 h后更换成正常培养液，转染48 h分别收集3组SiHa细胞，进行相关指标检测。

1.5 Western blot检测 取出保存的宫颈癌组织及癌旁组织标本，研磨并加入RIPA裂解液提取蛋白，转染48 h 3组SiHa细胞加入RIPA裂解液提取总蛋白。提取的蛋白以BCA法测定浓度，加热变性后，取40 μg蛋白行SDS-PAGE电泳，蛋白分离后转移到PVDF膜上，将膜浸入5%脱脂牛奶中封阻2 h，洗膜后加入相应一抗(CDKN2A一抗为1∶500稀释，PCNA、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9一抗均为1∶800稀释，β-catenin和c-myc一抗均为1∶1 000稀释)，4℃孵育过夜，洗膜后加入1∶3 000稀释的二抗，置摇床上孵育2 h，洗膜后加入ECL显色试剂，避光显影，以凝胶成像系统采集图像，用GAPDH标定，采用Image J软件分析3组SiHa细胞中目的蛋白相对表达水平。实验至少重复3次。

1.6 MTT实验 转染后，即将3组SiHa细胞以5×103个/孔接种到96孔板中，每组设置3个复孔，放置在37℃培养箱常规培养，48 h后向细胞中加入MTT试剂(100 μl/孔)，37℃培养箱中继续培养4 h，除去培养液，再向细胞中加入二甲基亚砜(150 μl/孔)，于摇床上反应10 min，待沉淀全部溶解后使用酶标仪测定各孔细胞在450 nm波长处光密度(OD)值，计算3组SiHa细胞存活率，细胞存活率=试验组OD值/对照组OD值×100%。实验至少重复3次。

1.7 AnnexinⅤ-FITC/PI双染色法检测 3组SiHa细胞转染48 h用胰酶消化，预冷的PBS将细胞洗涤2次，收集约1×105个细胞，向细胞中加入Binding Buffer缓冲液100 μl重悬细胞，将细胞悬液加入到流式管内，再向管中添加AnnexinⅤ-FITC 5 μl，PI 5 μl，充分混匀，室温下避光反应15 min，再向管中加入Binding Buffer缓冲液400 μl，混匀，立即上流式细胞仪检测。实验至少重复3次。

2 结果

2.1 CDKN2A在宫颈癌组织中的表达 与癌旁组织相比，CDKN2A在宫颈癌组织中的蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。见图1，表1。

图1 Western blot检测宫颈癌组织和癌旁组织中CDKN2A蛋白表达

表1 宫颈癌组织和癌旁组织中CDKN2A蛋白表达水平比较

2.2 转染CDKN2A过表达载体质粒后SiHa细胞中CDKN2A的蛋白表达 Western blot检测转染48 h后Control组、pcDNA组和pc-CDKN2A组SiHa细胞中CDKN2A的蛋白表达。与pcDNA组相比，pc-CDKN2A组SiHa细胞中CDKN2A的蛋白表达水平明显升高(P<0.05)；与Control组相比，pcDNA组中CDKN2A的蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。见图2，表2。

表2 3组SiHa细胞中CDKN2A蛋白表达水平比较

图2 Western blot检测3组SiHa细胞中CDKN2A的蛋白表达

2.3 过表达CDKN2A降低SiHa细胞的增殖能力 与pcDNA组相比，pc-CDKN2A组SiHa细胞存活率明显降低(P<0.05)，而Control组SiHa细胞存活率差异无统计学意义(P>0.05)。Western blot进一步检测与增殖相关蛋白PCNA的表达，与pcDNA组相比，pc-CDKN2A组SiHa细胞中PCNA蛋白表达明显下调(P<0.05)，而Control组PCNA的表达无明显变化(P>0.05)。见图3，表3。

图3 Western blot检测3组SiHa细胞中PCNA的表达

表3 3组SiHa细胞存活率和PCNA蛋白表达水平比较

2.4 过表达CDKN2A促进SiHa细胞的凋亡 AnnexinⅤ-FITC/PI双染色法检测转染48 h后3组SiHa细胞凋亡率。与pcDNA组相比，pc-CDKN2A组SiHa细胞凋亡率显著升高(P<0.05)，而Control组细胞凋亡率无明显改变(P>0.05)。Western blot检测凋亡相关蛋白Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9表达水平。与pcDNA组相比，pc-CDKN2A组SiHa细胞中Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9蛋白表达均明显上调(P<0.05)，而Control组Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9的表达均无明显改变(P>0.05)。见图4，表4。

表4 3组SiHa细胞凋亡率及Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9蛋白表达水平比较

图4 干扰CDKN2A对SiHa细胞凋亡的影响;A AnnexinⅤ-FITC/PI双染色法检测3组SiHa细胞凋亡；B Western blot检测3组SiHa细胞中Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9蛋白表达

2.5 过表达CDKN2A抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活 Western blot检测SiHa细胞中Wnt/β-catenin信号通路关键蛋白β-catenin和下游关键分子c-myc表达情况，与pcDNA组相比，pc-CDKN2A组SiHa细胞中β-catenin和c-myc蛋白表达水平均明显下调(P<0.05)，而Control组β-catenin和c-myc的表达水平均无明显改变(P>0.05)。见图5，表5。

图5 Western blot检测SiHa细胞中β-catenin和c-myc的表达

表5 3组SiHa细胞中β-catenin和c-myc蛋白表达水平比较

3 讨论

宫颈癌是女性常见的恶性肿瘤之一，其发病率较高，特别是在许多发展中国家[10]。中国国家癌症中心早些时候公布的数据显示，宫颈癌的发病率和死亡率分别为10.4/105和2.59/105。随着肿瘤治疗手段不断发展，其中基因治疗取得较好的治疗效果[11]。目前有研究证实，通过对宫颈癌患者实施基因治疗能够有效抑制宫颈癌细胞的生长[12]。CDKN2A是一个经典的肿瘤抑制基因，可参与调控细胞周期进程来抑制细胞增殖和分裂。有研究显示，CDKN2A在乳腺癌、胰腺癌等多种实体瘤中表达缺失，并且CDKN2A的突变与肿瘤患者临床分期、病理类型及预后密切相关[13,14]。本研究中，通过Western blot检测宫颈癌组织和相应癌旁组织中CDKN2A的表达，结果发现CDKN2A在宫颈癌组织中的表达明显下调，提示CDKN2A在宫颈癌中发挥抑癌基因的作用。

有研究显示，CDKN2A可调控乳腺癌MDA-MB-231细胞、鼻咽癌C666-1细胞的增殖[15,16]。Alsaran等[17]研究发现，锌通过增强人乳腺癌MCF-7细胞中CDKN2A的表达诱导细胞凋亡。宫颈癌的发病是一种复杂的病理过程，其中宫颈癌细胞的增殖和凋亡起着重要作用。本实验通过在人宫颈癌SiHa细胞中过表达CDKN2A以探究其对SiHa细胞增殖和凋亡的影响，并初步探索其作用机制。MTT和AnnexinⅤ-FITC/PI双染色法检测结果发现，过表达CDKN2A能够抑制SiHa细胞增殖并促进细胞凋亡。PCNA参与细胞中DNA的合成过程，存在与处于增殖及肿瘤细胞中，在宫颈癌、胃癌等恶性肿瘤中异常表达，目前公认其为肿瘤细胞处于增殖的标志分子之一[18]。Caspase-3和Caspase-9是Caspase家族重要成员，当细胞接受凋亡信号刺激激活凋亡启动因子Caspase-9，进而引发线粒体凋亡途径经一系列级联反应激活细胞凋亡执行者Caspase-3，最终诱发细胞凋亡[19]。本实验结果显示，过表达CDKN2A可下调PCNA的表达，上调Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9的表达，提示CDKN2A可通过调控PCNA的表达及Caspase-3和Caspase-9的激活影响SiHa细胞增殖和凋亡。

Wnt/β-catenin信号传导途径是一系列由癌基因和抗癌基因编码的蛋白质组成，并且特别涉及胚胎发育，细胞内转运和细胞凋亡等过程。此外，Wnt/β-catenin信号通路的异常激活与各种类型癌症的肿瘤发生、侵袭和转移密切相关[20]。许多Wnt/β-catenin信号传导途径成员的上调与某些癌症类型有关，先前已在多种癌症中检测到β-catenin的过度表达，例如宫颈癌、肠癌和卵巢癌[21-23]。在激活Wnt/β-catenin信号传导过程中，β-catenin通过TCF/淋巴增强因子DNA结合蛋白与DNA相互作用，随后激活下游靶基因的表达，编码促进细胞增殖的c-Myc。本研究中，过表达CDKN2A可下调β-catenin和下游靶基因c-Myc的表达，表明过表达CDKN2A能够抑制Wnt/β-catenin途径的激活。提示过表达CDKN2A可能通过阻断Wnt/β-catenin信号通路的激活抑制SiHa细胞增殖，诱导细胞凋亡。

综上所述，CDKN2A在宫颈癌组织中呈低表达，过表达CDKN2A能够抑制宫颈癌SiHa细胞增殖，并促进细胞凋亡，其作用机制可能与抑制Wnt/β-catenin信号通路的活化有关。本实验结果提示，CDKN2A有望成为宫颈癌靶向治疗的一个新的靶点。