茯苓提取物以miR-649/Akt1通路调控AngⅡ诱导血管平滑肌细胞的增殖、迁移和侵袭机制

姚卫 黄伟 张斌

心血管疾病是一种严重威胁人类尤其是中老年人群健康的常见疾病。动脉粥样硬化是一个慢性炎症过程，也是心血管疾病致死的主要原因之一，其中血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)的增殖、迁移等是动脉粥样硬化的关键环节[1,2]。血管紧张素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ，AngⅡ)可介导VSMCs细胞的活化、增殖、迁移等，抑制AngⅡ诱导的VSMCs细胞增殖和迁移对防治心血管疾病具有重要意义[3]。茯苓是中国的一种传统中药材，多用于风湿性关节炎、皮肤病等疾病的治疗。杨鹏飞[4]研究显示，桂枝茯苓胶囊可抑制血清诱导的血管平滑肌细胞增殖。目前，茯苓提取物对AngⅡ诱导的VSMCs细胞生物学行为的影响还未知。微小RNA(microRNA，miRNA)是一类小分子非编码单链RNA，参与调控细胞的增殖、迁移、凋亡等生物学行为，与疾病的发生发展密切相关[5]。研究显示，miR-649在去血清处理的血管平滑肌细胞中表达增加[6]，提示miR-649可能参与调控VSMCs细胞的生物学行为。本研究通过AngⅡ诱导的VSMCs细胞，探讨茯苓提取物对VSMCs细胞增殖、迁移和侵袭的影响及作用机制，以期为动脉粥样硬化治疗药物的研发提供一定的新方向。

1 材料与方法

1.1 细胞与实验试剂 人主动脉血管平滑肌细胞(HA-VSMCs)购自美国ScienCell公司；胎牛血清(Fetal Bovine Serum，FBS)、DMEM高糖培养基和BCA蛋白测定试剂盒购自北京索莱宝公司；胰蛋白酶和四甲基噻唑蓝(methylthiazoletrazolium，MTT)购自美国Sigma公司；逆转录试剂盒和PCR试剂盒购自美国Fermentas公司；LipofectamineTM 2000试剂盒和Trizol试剂，美国Invitrogen公司；PCR引物由上海生工生物工程有限公司设计并合成；miR-649模拟物(mimics)及模拟阴性对照物、抑制剂及阴性对照序列、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(serine/threonine protein kinase 1，Aktl)野生型质粒(WT-Aktl)和突变型质粒(MUT-Aktl)，由上海吉凯基因公司合成；兔抗人细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、p21多克隆抗体购自多Anbo生物科技有限公司；上皮性钙粘附蛋白(Epithelial cadherin，E-cadherin)抗体购自武汉维克赛思科技有限公司；基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)、Akt1和磷酸化的Akt1(phosphorylated Aktl，p-Akt1)抗体购自美国Santa Cruz公司；双荧光素酶活性检测试剂盒，美国Promega公司。

1.2 实验方法

1.2.1 制备茯苓提取物:参照文献[7]方法制备茯苓提取物。首先将茯苓中药饮片粉碎，过200目筛。准确称取5.0 g样品，加入200 ml蒸馏水，回流提取1 h。回流结束后，4℃、10 000 r/min离心10 min。取上清液，80℃旋转蒸发至25 ml左右。然后真空冷冻干燥处理，-20℃保存备用。实验前，用超纯水配置为含生药量1.0 g/L的溶液，4℃储存备用。

1.2.2 VSMCs细胞培养:VSMCs细胞用含10 % FBS的DMEM高糖培养基于37℃、5% CO2、97%湿度的培养箱中培养。依据细胞生长状况，每2～3天更换1次新鲜的培养基。细胞融合至80%～90%时，0.25%胰蛋白酶消化，进行传代培养。

1.2.3 VSMCs细胞分组处理:VSMCs细胞分组，AngⅡ组：10-7mol/L[8]的AngⅡ作用VSMCs不同时间(24、48和72 h)；AngⅡ+茯苓提取物组：10-7mol/L的AngⅡ与不同浓度的茯苓提取物共同作用VSMCs不同时间；对照组：培养基培养相同时间。miR-649组：转染miR-649模拟物；miR-NC组：转染模拟阴性对照物；anti-miR-649组：转染miR-649抑制剂；anti-miR-NC组：转染抑制剂阴性对照。具体转染操作参照LipofectamineTM2000试剂盒操作说明。AngⅡ+miR-649组：10-7mol/L的AngⅡ作用于转染miR-649 mimics的VSMCs细胞；AngⅡ+miR-NC：10-7mol/L的AngⅡ作用于转染模拟阴性对照物的VSMCs细胞。AngⅡ+茯苓提取物20 mg/ml+anti-miR-649组：10-7mol/L的AngⅡ与20 mg/ml的茯苓提取物共同作用转染miR-649抑制剂的VSMCs细胞；AngⅡ+茯苓提取物20 mg/ml+anti-miR-NC组：10-7mol/L的AngⅡ与20 mg/ml的茯苓提取物共同作用转染抑制剂阴性对照序列的VSMCs细胞。

1.2.4 MTT检测细胞增殖活性:VSMCs细胞或转染后的6组VSMCs细胞，以2.5×104个/ml的浓度接种于96孔板中，每孔200 μl。细胞贴壁后，按照上述分组处理。细胞培养结束后，每孔加入20 μl的MTT溶液(5 g/L)，继续孵育4 h。然后吸弃培养基，加入150 μl 二甲基亚砜，振荡混合均匀，酶标仪490 nm处测定吸光度值(A)。

1.2.5 Transwell检测细胞的迁移和侵袭能力:VSMCs细胞或转染后的6组VSMCs细胞，用不含FBS的DMEM培养基调整浓度为5×104个/ml。细胞迁移实验：取100 μl细胞悬液加入Transwell上室。下室加入500 μl含FBS的DMEM培养基。培养6 h后，吸弃上室培养基，加入含10-7mol/L的AngⅡ和(或)20 mg/ml茯苓提取物共同作用48 h后。培养结束后，4%多聚甲醛固定30 min，自然晾干后，0.4%结晶紫染色15 min。然后使用倒置显微镜观察，随机选取5个视野，计数。细胞侵袭实验：取100 μl细胞悬液加入至铺有Matrigel基质胶的Transwell上室，剩余操作与细胞迁移实验相同。

1.2.6 实时荧光定量PCR检测miR-649表达:Trizol试剂提取细胞中总RNA，并逆转录为cDNA。以cDNA为模板，行PCR扩增。PCR扩增条件：95℃ 5 min，95℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共35个循环。引物序列：miR-649上游5’-TTTGGGCTACCATGTTCGG-3’；下游5’-CCGAACATGGTAGCCCAAA-3’；U6上游5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’；下游5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。以U6为内参，2-ΔΔCt法计算miR-649的相对表达水平。

1.2.7 Western Blot法检测蛋白表达:加入RIPA蛋白裂解液提取细胞中总蛋白，BCA试剂盒对蛋白进行定量。取适量蛋白，100℃煮沸5 min变性后，以每孔30 μg 蛋白进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后，湿转至硝酸纤维素膜。然后将硝酸纤维素膜置于5 %脱脂牛奶中封闭，时间为2 h。加入一抗，4℃孵育过夜。加入辣根过氧化酶标记的二抗，37℃孵育1 h。加入ELC显影液，避光显影，凝胶成像系统曝光拍照。以GAPDH为内参，Image J软件分析蛋白条带灰度值。

1.2.8 双荧光素酶报告基因实验:构建Aktl野生型质粒(WT-Aktl)和突变型质粒(MUT-Aktl)。VSMCs细胞以5×104个/ml的浓度接种于96孔板中，每孔2 ml。代细胞融合至60 %时，分别将WT-Aktl、MUT-Aktl与miR-649 mimic、模拟阴性对照物共转染至VSMCs细胞。转染48 h后，收集细胞。参照双荧光素酶活性检测试剂盒操作说明，检测荧光素酶活性，结果以荧光虫活性/海肾荧光强度比值表示6组的荧光素酶活性。

2 结果

2.1 茯苓提取物对AngⅡ作用的VSMCs细胞增殖、迁移、侵袭的影响 与对照组比较，AngⅡ组VSMCs细胞培养24、48、72 h后的活性、Cyclin D1蛋白表达水平升高(P<0.05)，P21蛋白表达水平降低(P<0.05)。与AngⅡ组比较，AngⅡ+茯苓提取物(10、20、50 mg/ml)组VSMCs细胞培养24、48、72 h后的活性、Cyclin D1蛋白表达水平降低(P<0.05)，P21蛋白表达水平升高(P<0.05)，且AngⅡ+茯苓提取物20 mg/ml组细胞培养48 h的活性约为AngⅡ组的50%，因此后续实验选择20 mg/ml的茯苓提取物作用细胞48 h进行后续实验。与对照组比较，AngⅡ组VSMCs细胞培养48 h后迁移和侵袭数量、MMP-2蛋白表达水平升高(P<0.05)，E-cadherin蛋白表达水平降低(P<0.05)。与AngⅡ组比较，AngⅡ+茯苓提取物20 mg/ml组VSMCs细胞培养48 h后迁移和侵袭数量、MMP-2蛋白表达水平降低(P<0.05)，E-cadherin蛋白表达水平升高(P<0.05)。见图1，表1、2。

图1 茯苓提取物对AngⅡ作用的VSMCs细胞增殖、迁移、侵袭的影响；A 茯苓提取物对AngⅡ作用的VSMCs细胞迁移、侵袭的影响;B 茯苓提取物对AngⅡ作用的VSMCs细胞增殖蛋白表达的影响;C 茯苓提取物对AngⅡ作用的VSMCs细胞迁移、侵袭蛋白表达的影响

表1 茯苓提取物对AngⅡ作用的VSMCs细胞增殖的影响

表2 茯苓提取物对AngⅡ作用的VSMCs细胞迁移、侵袭的影响

2.2 茯苓提取物对AngⅡ作用的VSMCs细胞中miR-649、p-Akt1表达的影响 与对照组比较，AngⅡ组VSMCs细胞培养48 h后miR-649表达水平降低(P<0.05)，Akt1和p-Akt1蛋白表达水平升高(P<0.05)。与AngⅡ组比较，AngⅡ+茯苓提取物20 mg/ml组VSMCs细胞培养48 h后miR-649表达水平升高(P<0.05)，Akt1和p-Akt1蛋白表达水平降低(P<0.05)。见图2，表3。

表3 茯苓提取物对AngⅡ作用的VSMCs细胞中miR-649、p-Akt1表达的影响

图2 茯苓提取物对AngⅡ作用的VSMCs细胞Akt1、p-Akt1蛋白表达的影响

2.3 过表达miR-649对AngⅡ作用的VSMCs细胞增殖、迁移和侵袭的影响 AngⅡ+miR-649组miR-649水平高于AngⅡ+miR-NC组，表明miR-649 mimics转染成功。与AngⅡ+miR-NC组比较，AngⅡ+miR-649组VSMCs细胞培养24、48、72 h后的活性、迁移和侵袭数量、Cyclin D1和MMP-2蛋白表达水平降低(P<0.05)，P21和E-cadherin蛋白表达水平升高(P<0.05)。见图3，表4、5。

图3 过表达miR-649对AngⅡ作用的VSMCs细胞增殖、迁移、侵袭蛋白表达的影响

表4 过表达miR-649对AngⅡ作用的VSMCs细胞增殖的影响

表5 过表达miR-649对AngⅡ作用的VSMCs细胞迁移、侵袭的影响

2.4 miR-649靶向调控Akt1表达 生物信息学软件显示，Akt1的3’UTR含有与miR-649互补的核苷酸序列。双荧光素酶活性检测结果显示，与miR-NC组比较，miR-649组转染WT-Akt1的荧光素酶活性降低(P<0.05)，而转染MUT-Akt1的荧光素酶活性物显著变化(P>0.05)，说明miR-649可Akt1的3’UTR靶向结合。Western Blot检测结果显示，miR-649组Akt1蛋白水平低于miR-NC组(P<0.05)，anti-miR-649组Akt1蛋白水平高于anti-miR-NC组(P<0.05)。见图4，表6、7。

图4 miR-649靶向调控Akt1表达；A Akt1的3’UTR含有miR-649的互补序列；B miR-649调控Akt1的表达

表6 双荧光素酶报告实验

2.5 抑制miR-649表达能逆转茯苓提取物对AngⅡ作用的VSMCs细胞增殖、迁移、侵袭的作用 与AngⅡ+茯苓提取物20 mg/ml+anti-miR-NC组比较，AngⅡ+茯苓提取物20 mg/ml+anti-miR-649组VSMCs细胞培养24、48和72 h后的活性、迁移和侵袭数量、Cyclin D1、MMP-2、Akt1和p-Akt1蛋白表达水平升高(P<0.05)，miR-649、P21和E-cadherin蛋白表达水平降低(P<0.05)。见图5，表8、9。

表7 miR-649调控Akt1的表达

图5 抑制miR-649表达能逆转茯苓提取物对AngⅡ作用的VSMCs细胞增殖、迁移、侵袭蛋白表达的影响

表8 抑制miR-649表达能逆转茯苓提取物对AngⅡ作用的VSMCs细胞增殖的影响

表9 抑制miR-649表达能逆转茯苓提取物对AngⅡ作用的VSMCs细胞增殖、迁移、侵袭的影响

3 讨论

研究显示，VSMCs细胞的异常增殖、迁移可促进血管动脉粥样硬化的形成，抑制VSMCs细胞的异常增殖及迁移可有效延缓血管动脉粥样硬化的发展进程[9]。AngⅡ是一种血管活性物质，可促进VSMCs细胞增殖和迁移。本研究结果显示，AngⅡ作用VSMCs细胞后，VSMCs细胞增殖、迁移和侵袭能力增加，与增殖、迁移和侵袭相关的蛋白Cyclin D1和MMP-2表达升高，P21和E-cadherin蛋白表达降低，与相关报道结果[10]一致。作为传统的中药材，茯苓味甘、淡、性平，具有较高的药用价值。研究显示，茯苓提取物可通过激活线粒体介导的caspase途径抑制非小细胞肺癌A549细胞的增殖[11]，诱导人白血病U937细胞凋亡[12]。本研究结果显示，茯苓提取物可抑制AngⅡ诱导的VSMCs细胞增殖、迁移和侵袭及Cyclin D1和MMP-2蛋白表达，促进P21和E-cadherin蛋白表达，提示茯苓提取物是潜在的治疗血管动脉粥样硬化的药物。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一类小分子单链非编码RNA，长度为18～25个核苷酸，广泛存在于真核生物中。研究显示，miRNA参与VSMCs细胞的生物学特性，在心血管疾病中发挥重要作用。万正英等[13]研究显示，miR-425可通过调控 PTEN/PI3K/AKT 信号通路抑制AngⅡ诱导的人主动脉VSMCs细胞增殖和迁移，可作为血管重构的潜在诊疗靶点。Guo等[14]研究显示，miR-145可通过靶向负调控CD40表达抑制VSMCs细胞增殖。miR-649是近年来新发现的一种miRNA。目前，miR-649对VSMCs细胞增殖、迁移和影响还未知。本研究结果显示，AngⅡ作用VSMCs细胞后，细胞中miR-649表达水平降低，提示miR-649参与血管动脉粥样硬化的发生和发展。过表达miR-649后，AngⅡ诱导的VSMCs细胞增殖、迁移和侵袭能力降低，Cyclin D1和MMP-2蛋白表达降低，而且P21和E-cadherin蛋白表达升高，表明过表达miR-649可抑制AngⅡ诱导的VSMCs细胞增殖、迁移和侵袭。本研究结果还显示，茯苓提取物作用AngⅡ诱导的VSMCs细胞后，miR-649表达水平升高，抑制miR-649表达逆转了茯苓提取物对AngⅡ诱导的VSMCs细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用，提示茯苓提取物通过上调miR-649表达抑制AngⅡ诱导的VSMCs细胞增殖、迁移和侵袭。

miRNA通常与靶基因的3’UTR靶向结合调控靶基因的表达，进而影响细胞的生物学行为[15]。本研究通过生物信息学软件预测显示，Akt1的3’UTR与miR-649的核苷酸序列存在结合位点，并通过双荧光素酶实验和检测Akt1蛋白水平证实了Akt1在VSMCs细胞中靶向负调控Akt1表达。Akt1是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，参与细胞的生长、凋亡等生命活动。韩阳等[16]研究显示，AngⅡ处理小鼠动脉血管平滑肌细胞后，细胞中Akt磷酸化水平升高。曹学照等[17]研究显示，肾素前体可通过激活Akt通路诱导血管平滑肌细胞增殖。提示Akt1参与调控血管平滑肌细胞的生物学行为。本研究显示，AngⅡ刺激可促进VSMCs细胞Akt1和p-Akt1蛋白表达，而茯苓提取物可降低AngⅡ诱导的VSMCs细胞Akt1和p-Akt1蛋白表达，进一步说明茯苓提取物通过上调miR-649表达，通过下调Akt1表达抑制AngⅡ诱导的VSMCs细胞增殖、迁移和侵袭。

综上所述，茯苓提取物可抑制AngⅡ诱导的VSMCs细胞增殖、迁移和侵袭，其作用机制与上调miR-649表达，进而下调Akt1表达有关。这为茯苓提取物治疗血管动脉粥样硬化及心血管疾病的防治提供了一定的实验依据。