水稻去泛素化酶OsUCH-L5基因的克隆及表达分析

陈立杰， 方远鹏， 杜巧丽， 陈 俊， 蒋君梅， 陈美晴， 李向阳， 谢 鑫

(1.贵州大学资产经营办公室， 贵阳 550025；2.贵州大学农学院农业微生物特色重点实验室， 贵阳 550025；3.贵州大学绿色农药与农业生物工程教育部重点实验室， 贵阳 550025)

水稻(Oryzasativa)是世界五大粮食作物之一，主要分为籼稻和粳稻或糯稻，是中国及部分国家的主粮。随着水稻基因组组装的完成，对水稻基因水平研究已成为热点[1]，其中蛋白翻译后修饰过程也成为研究的焦点之一[2-4]。

泛素化是一类小分子蛋白，在酶(泛素激活酶[5]、结合酶[6]及连接酶[7])的调控下，能对靶标蛋白进行特异性修饰[8]，同时泛素化在蛋白质功能体现[9]及降解[10-11]过程中具重要作用；泛素化还间接参与细胞凋亡[12]、植物免疫反应[13]、营养运输[14]、水分抗性[15]、损伤修复[16]等各种生命活动。而去泛素化酶(Deubiquitinases，DUBs)则可以逆转泛素化过程，辅助调节生命活动；其主要包括UBP/USP(泛素特异性蛋白酶)家族﹑UCH(泛素C末端水解酶)家族﹑OTU(卵巢肿瘤蛋白酶)家族、MJD(MachadoJoseph域)家族和JAMM(JAB 1/MPN/MOV 34蛋白酶)家族[17]。研究报道去泛素化酶在抗病响应[18]、细胞增殖[19]、植物转录调控[20]等多个方面起着重要的调节作用。

泛素C端水解酶(ubiquitin carrboxy terminal hydrolases，UCHs)在蛋白质的降解过程中具有反向调控作用，可促进泛素的再循环。研究报道，UCHs可通过去泛素化的作用对细胞周期产生影响，并且在代谢调控、转录调控以及DNA修复等过程中具有关键作用[20]。UCH- L 5(UCH 37)被作为DUBs中泛素C末端水解酶(UCH)家族的半胱氨酸蛋白酶，主要由蛋白酶体和INO 80染色质复合体组成[21]。据报道，在癌细胞中对UCH-L5基因进行过表达或进行基因敲除，可使小鼠在胚胎期致死[22-23]；同时该基因可能参与调节生物体的寿命[24]。而在植物拟南芥中，AtUCH4突变体能产生较野生型更耐强盐、脱落酸(ABA, abscisic acid)的抗性[20]；AtUCH4同时更能抵抗低温逆境，并与AtPTP1基因形成负相关的基因对[25]。拟南芥中过量表达AtUCH1基因时，对生长素信号通路具有一定促进作用(如促使生长素不敏感型突变体恢复正常[26])。此外，去泛素化酶UCH-L 3与K 27链接类型二泛素(K 27 diub)互作可促进DNA的损伤修复[27-28]。

近年来关于植物UCH家族的研究主要集中在UCH-L 3和UCH 4，对UCH-L 5在植物中的研究报道较少，本研究对水稻OsUCH-L5基因的序列特征以及表达模式进行探究，以期为OsUCH-L5的泛素化模型研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1材 料

水稻材料日本晴(OryzaSativaL. spp.japonica)品种保存于贵州大学植物病理教研室。

1.1.2试 剂

本实验中所用的反转录试剂盒购于普洛麦格(北京)生物技术有限公司，SYBR荧光染料购自北京康润诚业生物科技有限公司。所用的激素，盐胁迫和其它胁迫处理剂均购自北京酷来搏科技有限公司。

1.2 生物信息学分析

利用MEGA 7.0软件，以邻接法(Neighbor-Joining，NJ)(bootstrap=1000)方式构建无根进化树，并于EvolView美化。采用HMMER(https://www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/)联合SMART获得OsUCH-L 5蛋白的保守域；使用EXPASy软件完成OsUCH-L 5蛋白的理化性质测定与亲水性分析；OsUCH-L 5蛋白的二级结构和亚细胞定位在PSIPRED(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)和Softberry(http://www.softberry.com)分别进行预测。并基于SWISS-MIDEL网站直接预测SWISS-MODEL及PyMOL单模型构建蛋白质三级结构。

1.3 OsUCH-L5基因克隆与重组载体的构建

1.3.1总RNA的提取与cDNA的反转录

取水稻日本晴三叶期植株，利用RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒分别完成水稻RNA的提取及反转录，所获cDNA于-80 ℃超低温冰箱冻存。

1.3.2OsUCH-L5基因的克隆

根据NCBI数据库中水稻染色体注释信息直接获得了水稻OsUCH-L5(NCBI编号：LOC 4331185)，依据提供的CDS序列及已获的cDNA模板，设计引物(表1)并扩增OsUCH-L5基因，扩增产物连接到中间载体pEASY上。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.4 UCH-L5基因的表达情况分析

1.4.1UCH-L5基因的非生物逆境表达特征

取水稻种子灭菌消毒后，种植于灭菌营养土中，待水稻长到三叶期时，取水稻根、茎、叶组织，提取RNA用并反转录cDNA后，用特异性引物(表1)进行RT-qPCR(quantitative Real-time PCR，RT-qPCR)检测。处理组的材料选取长势一致的植株，通过4 ℃低温和40 ℃高温处理，并利用脱落酸(ABA，200 μmol·L-1)、D-甘露醇(D-mannitol，1 mmol·L-1)、氯化钠(NaCl，250 mmol·L-1)、油菜素内酯(BR，200 μmol·L-1)分别进行干旱、盐胁迫及激素处理。最后分别在0 h、0.5 h、1 h、3 h、6 h、9 h、12 h和24 h取样，设置3个生物学重复，每个重复处理5株苗，并将样本-80 ℃超低温保存备用。

1.4.2数据整理与分析

RT-qPCR结果以2-ΔΔCt方法进行分析，并利用SPSS软件进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 水稻去泛素化酶编码基因OsUCH-L5的克隆

用OsUCH-L5-F/OsUCH-L5-R引物(表1)进行扩增经水稻总RNA逆转录获得的cDNA，得到目的基因大小为837 bp，其编码278个氨基酸。经测序以及1%琼脂糖凝胶电泳检测后，发现条带大小与数据库预测大小一致(图1)。

2.2 OsUCH-L 5蛋白的序列分析

2.2.1OsUCH-L 5蛋白的理化性质预测及亚细胞定位

利用ProtComp软件对OsUCH-L 5蛋白进行亚细胞定位，预测该蛋白定位于细胞核，符合该类亚家族的特点。Prot-param软件预测OsUCH-L 5蛋白理化性质结果显示，其相对分子质量31.644 08 kD，等电点为5.66，氨基酸共278个，且谷氨酸(Glu)含量最多，达到10.4%。负电荷及正电荷残基分别为43个和39个，脂肪指数为82.16，不稳定指数为48.88，该蛋白较不稳定，具强亲水性(表2)。

表2 OsUCH-L 5蛋白的基本理化性质Table 2 Basic physical and chemical parameters of OsUCH-L 5 protein

2.2.2OsUCH-L 5蛋白的序列分析

根据MEGA 7以邻接法完成系统进化树的构建，并结合SMART及HMMER对其结构进行预测，SMART结果显示，OsUCH-L 5蛋白2-153及163-220处具一个Peptidase_C 12结构域和一个卷曲区域。且所有的UCH-L 5蛋白均具备一个Ⅰ亚族结构的Peptidase_C 12保守域及一段UCH_C的UCH家族识别保守域。水稻OsUCH-L 5和二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)BdUCH-L 5亲缘关系最近，且同科内蛋白在系统进化树上聚合为一支(图2)。

2.2.3水稻OsUCH-L 5蛋白结构及亲水性分析

利用ProtScale网站获得OsUCH-L 5蛋白(图3 A)亲水性情况，结果表明，其亲水性上下限为1.756和-3.000，疏水区主要在20～40 aa、105～115 aa、124～130 aa、162～168 aa、205～219 aa、242～250 aa，显示OsUCH-L 5蛋白具有强亲水性。通过SWISS-MODEL预测蛋白质三级结构，显示OsUCH-L 5蛋白主要由螺旋和无规则卷曲构成(图3 B)。

2.3 OsUCH-L5基因表达分析

2.3.1OsUCH-L5基因的组织表达分析

以水稻Ubiquitin为内参基因，分析OsUCH-L5在不同组织的表达模式。qRT-PCR结果表明，水稻OsUCH-L5基因在根、茎、叶不同组织均有表达，在根中的表达量最高，即根>叶>茎(图4 A)。

2.3.2OsUCH-L5基因在NaCl及模拟干旱胁迫下的应答分析

为阐明干旱和盐分胁迫中OsUCH-L5基因的作用，通过RT-qPCR检测NaCl、ABA、D-mannitol处理下OsUCH-L5基因的表达情况。结果显示，在盐处理下，OsUCH-L5基因表达在极短时间内显著降低，但在处理6 h之后，OsUCH-L5基因表达量显著上升，并在12 h达到最大值(图4 B)。利用ABA和D-mannitol模拟干旱胁迫，结果显示，OsUCH-L5基因在ABA处理6 h时基因表达量显著增加至峰值，之后显著下降(图4 C)。而在D-mannitol处理下，OsUCH-L5基因在0.5 h显著上升达到最大值，之后又出现下调(图4 D)。

2.3.3OsUCH-L5基因在BR下的应答分析

为探究BR对OsUCH-L5基因表达影响，采用RT-qPCR进行定量分析。结果显示，OsUCH-L5基因表达量呈现先升后降模式，于3 h达到峰值。在6 h后OsUCH-L5基因表达量与对照相同(图5 A)。

2.3.4OsUCH-L5基因温度胁迫分析

为探索OsUCH-L5基因是否受到温度胁迫的影响，分别在4 ℃低温和40 ℃高温胁迫处理后，对其进行表达分析。结果显示，OsUCH-L5基因在低温及高温处理下，均在0.5 h时基因表达量显著降低，但在连续低温(图5 B)及高温(图5 C)处理下，分别在3 h和1 h时，基因表达量显著增加至峰值，随后又逐渐降低。说明OsUCH-L5基因能迅速响应温度胁迫信号(图5 C)。

3 讨 论

泛素化调节被作为生物体内必不可少的可逆性调节途径，在生物体生长发育过程中具有重要意义，其可逆过程主要由泛素化酶的修饰[29]及去泛素化酶[30]的修饰完成。去泛素化酶同时还参与生物器官发育[26,31]、细胞分化[32]等过程，其广泛参与到对动物肿瘤[33]、植物免疫抗性[34-37]以及病原物的致病性等方面[38-39]。

UCH家族作为去泛素化酶重要的一员，其翻译产物能协调多种蛋白质共同完成对生物或非生物应激的反应，刘石娟[25]的研究表明，AtUCH4/AtPTP1基因的表达与盐胁迫相关，具有正调控作用。张静进一步对AtUCH4基因在各种非生物逆境下的反应进行研究，更进一步明确了AtUCH4基因在组织表达的选择性以及受到ABA的正调控[20]。

本研究中OsUCH-L5基因的表达具有组织特异性，在根中表达量最高，而在叶和茎中表达较弱；这与拟南芥中AtUCH4基因在根中选择性表达具有相似性[25]。张静[20]的研究表明，AtUCH4基因的表达受到盐胁迫以及ABA的诱导表达。这与本研究中OsUCH-L5基因表达结果一致，在模拟干旱(ABA，D-manntiol)和盐胁迫(NaCl)处理下，OsUCH-L5基因表达量也上调表达。

油菜素内酯是植物重要的生长调节剂和药害解除剂，可促进植物对多种逆境反应进行适应[40]。本研究发现OsUCH-L5基因在油菜素内酯的处理下，OsUCH-L5基因受到诱导表达，这一结果与ABA或NaCl处理结果相似，因此，推测OsUCH-L5基因参与多种胁迫信号反应；同时在4 ℃或40 ℃胁迫处理下，OsUCH-L5均受到诱导表达，均在3 h时表达水平最高；刘石娟等[25]的研究提出，UCH基因可能与温度响应有关，主要受到温度的负调控，这与本研究中水稻OsUCH-L5基因受温度诱导表达不同，可能是由于温度持续胁迫时间不同所导致的。

4 结 论

本研究克隆了水稻OsUCH-L5基因，全长837 bp，编码278个氨基酸。生物信息学预测结果表明，该蛋白具有Peptidase_C 12和UCH_C结构域，相对分子质量为31.64 kDa，等电点为5.66，与二穗短柄草BdUCH-L 5亲缘关系最近。OsUCH-L5基因具组织特异性，在根部表达最佳；此外，OsUCH-L5基因分别参与对盐、干旱、激素以及温度胁迫的反应。该研究为进一步研究水稻OsUCH-L5基因功能提供基础。